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xclj369ouc金蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】ITS測序 已有13人參與
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請教大家誰有測過ITS序列? 是直接PCR產(chǎn)物測序的,還是克隆測序的? |
專家顧問 (知名作家)
生物大分子降解酶
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首先轉(zhuǎn)錄酶有很多種,雖然準(zhǔn)確度很高,但是擴(kuò)增產(chǎn)物多,即使是一億分之一的出錯(cuò)率,也會有極少數(shù)堿基出錯(cuò)。 連接到載體上之后轉(zhuǎn)化宿主,在宿主體內(nèi)擴(kuò)增的過程中,由一個(gè)拷貝增加到億個(gè)拷貝,宿主的擴(kuò)增系統(tǒng)會產(chǎn)生極少數(shù)堿基出錯(cuò)。 宿主郵寄到測序公司后進(jìn)行擴(kuò)增提取質(zhì)粒,質(zhì)粒又進(jìn)行多次擴(kuò)增,也可能出錯(cuò)。當(dāng)然也可以用菌體PCR,不過難度明顯比用質(zhì)粒為模板高。 這下應(yīng)該明白我為什么用PCR產(chǎn)物來測序了吧? |

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首先1kb可能一個(gè)反應(yīng)測不完,可能要依據(jù)第一個(gè)反應(yīng)之后的序列來重新設(shè)計(jì)引物測序,這個(gè)是測序公司負(fù)責(zé)的,送測序時(shí)說好是測通就行。2-7kb肯定是要多個(gè)反應(yīng)才能測通的,我沒有送過這么長的PCR產(chǎn)物去測序,所以不知道,以下說一下我的看法,不一定對。 我送過柯斯質(zhì)粒去測序,是3kb的載體與3.5kb的外源序列連接的產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化宿主后將宿主郵寄。測序公司可以培養(yǎng)宿主來提取質(zhì)粒作為模板,只要提取質(zhì)粒足夠多,模板的量就可以保證。7kb的長度要測7-9個(gè)反應(yīng)才能測通,所以可能可以直接測序,但要提供足夠多的PCR產(chǎn)物才能測完,這個(gè)問一下測序公司怎么操作的就能得到很明確的答復(fù)。 |

專家顧問 (知名作家)
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