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[交流]
【求助/交流】關(guān)于反向PCR 和測(cè)序結(jié)果的拼接 已有6人參與
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最近在做反向PCR·· 用的HaeIII酶切·· 彌散性條帶 回收800-2000bp 的片段，純化，用2ng/ul 的量進(jìn)行自環(huán)化。。但是之后的反向PCR 除了第一次跑出來(lái)一個(gè)，后面一直跑不出啊。。。 我想問(wèn)··· 如果反向PCR 的結(jié)果依然是彌散帶，是不是可以反復(fù)調(diào)整下體系繼續(xù)做呢？ 還是如果跑不出來(lái)就需要重新進(jìn)行自環(huán)化？ 不知道大家反向的PCR 的成功率一般高么？ 有什么好的經(jīng)驗(yàn)么？ 還有就是 反向PCR 測(cè)序的結(jié)果出來(lái)以后，應(yīng)該如何拼接呢？ 如何找到片段的連接點(diǎn)？ 求高人賜教·· 不甚感激！ |
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ben1147
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lstt09nk(金幣+2):鼓勵(lì)交流~~ 2010-08-14 15:44:08
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lstt09nk(金幣+2):鼓勵(lì)交流~~ 2010-08-14 15:44:08
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反向PCR只用一種酶不行啊 要是恰好相鄰兩個(gè)Hae III切點(diǎn)之間的片段太長(zhǎng)，自連以后的片段長(zhǎng)度就超出Taq的擴(kuò)增能力了，肯定P不出來(lái)?xiàng)l帶、彌散或者是非特異擴(kuò)增 多用幾種酶吧，至少五種以上 酶切充分一點(diǎn)，不用回收，產(chǎn)物直接純化后稀釋做連接 測(cè)序結(jié)果里面肯定有一個(gè)相應(yīng)切點(diǎn)的，切點(diǎn)兩邊序列分別做反向互補(bǔ)，就分別是已知片段上、下游的序列 [ Last edited by ben1147 on 2010-8-14 at 14:04 ] |
2樓2010-08-14 14:03:01
4樓2010-08-14 20:16:44
ben1147
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10樓2013-09-12 10:09:05
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