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xzd5517520銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】關(guān)于降落pcr的問(wèn)題！ 已有4人參與
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| 請(qǐng)教各位大俠：什么時(shí)候要做降落pcr??還有就是在pcr儀上是怎么設(shè)計(jì)的？？求教！ |
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小小豆豆
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降落PCR，主要用于PCR的條件的優(yōu)化。在許多情況下引物的設(shè)計(jì)使得PCR難以進(jìn)行，例如特異性不夠易錯(cuò)配等。退火溫度過(guò)高會(huì)使PCR效率過(guò)低，但退火溫度過(guò)低則會(huì)使非特異擴(kuò)增過(guò)多。這雖然可以通過(guò)反復(fù)嘗試來(lái)優(yōu)化，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力。降落PCR提供了一個(gè)較為簡(jiǎn)易的優(yōu)化方法。其原理大致是這樣的。首先在較高的溫度下擴(kuò)增，此時(shí)雖然擴(kuò)增效率低，但非特異擴(kuò)增基本沒(méi)有。隨著退火溫度的降低，非特異擴(kuò)增會(huì)逐步增多。但由于此時(shí)特異的擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到一定的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，因此會(huì)對(duì)非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)抑制，從而大幅提高PCR的特異性和效率。這一PCR技術(shù)已經(jīng)大量地進(jìn)入醫(yī)療臨床應(yīng)用�，F(xiàn)在，以高通量PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法、如人的 HLA分型 大多采用這一技術(shù)。 一般的PCR儀上，都可以通過(guò)每一次循環(huán)降低一定退火溫度的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，具體的看一下儀器說(shuō)明書(shū)就明白了，呵呵，不難的。  |
2樓2010-09-12 20:45:01
yujiaping1
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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amisking(金幣+2):鼓勵(lì)交流！ 2010-09-12 22:22:59
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| 原理，樓上說(shuō)的很清楚了，至于PCR設(shè)置，一般來(lái)說(shuō)PCR會(huì)有每個(gè)循環(huán)降低一定溫度的功能，即使沒(méi)有，自己手動(dòng)就可以，因?yàn)榻德銹CR只在前面幾個(gè)循環(huán)降落才有意義，所以手動(dòng)設(shè)置也不是很麻煩。廣義的降落PCR，也可能是幾個(gè)循環(huán)降落一次，這種情況還必須手動(dòng)設(shè)置 |
3樓2010-09-12 22:16:12
hongyuan1016
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| Touchdown PCR不是指溫度降低，而是升高。具體來(lái)說(shuō)是前幾個(gè)循環(huán)用一個(gè)低的退火溫度，然后提高溫度再幾個(gè)循環(huán)，然后再提高溫度再幾個(gè)循環(huán)，最后停在一個(gè)較高的溫度擴(kuò)增就行，這樣的話(huà)溫度低時(shí)擴(kuò)出的產(chǎn)物包括特異的和非特異的，溫度逐漸升高，將非特異逐漸選擇掉。以個(gè)人體會(huì)給你舉個(gè)例子：讓一個(gè)分子生物學(xué)的新手去建一個(gè)cDNA文庫(kù)，建成的可能性很小，如果讓這個(gè)人先按照建庫(kù)的程序拿別的東西鍛煉鍛煉，她建成文庫(kù)的可能性就會(huì)增大。 |
4樓2010-09-14 16:43:39
wjswj
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相比之下還是認(rèn)為二樓的對(duì)。非特異的東西會(huì)越來(lái)越多，而不會(huì)被選擇掉，PCR的優(yōu)勢(shì)（可怕之處）就在于會(huì)幾何級(jí)的增加。 請(qǐng)參考：http://baike.baidu.com/view/2200786.html?tp=4_01 |
5樓2010-09-14 17:01:52
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