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liubin專家顧問 (著名寫手)
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[交流]
【交流】SDS-PAGE
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本人以前未做過SDS-PAGE ，操作中遇到很多問題，至今未解決。 我將實驗中遇到的問題，按時間順序匯報如下，請大家不吝賜教。情況如下： 我使用的是凱基生物的全套試劑盒，使用的電泳槽為：BIO-RAD MINI-PROTEAN... 1. 按說明書配制分離膠和濃縮膠，及其他試劑。 分離膠凝膠時間2h 電流：10MA/30MA. 電泳時間：10h 結(jié)果：樣品幾乎一直停留在點樣點一下2cm處。 2。 將4×Tris-HCl/SDS, pH8.8 及4×Tris-HCl/SDS, pH6.8 稀釋4倍使用 分離膠凝膠時間2h，剩余膠不凝，膠版內(nèi)膠似乎已經(jīng)凝固，故繼續(xù)后續(xù)過程。 電流：10MA/50MA. 電泳時間：4h 結(jié)果：樣品幾乎一直停留在點樣點一下2cm處。 檢查發(fā)現(xiàn)，上槽漏液，但液面停留在梳齒一下位置左右，原因：上槽短玻璃板處未卡緊。 處理好漏液后繼續(xù)電泳，電流：10MA，30min，跑膠完成，染色后有條帶 3。 重復(fù)以上步驟，電流：10/15/30MA，9h，染色后有條帶。 我認(rèn)為，上述實驗均失敗，請大家?guī)兔φ乙幌略颉＞唧w請教一下問題： 1） 是否要同時設(shè)定電流和電壓？國外的資料是以功率w 來表示的。 2） 4×Tris-HCl/SDS, pH8.8 及4×Tris-HCl/SDS, pH6.8 是否要進(jìn)行稀釋？ 3）我使用的電泳儀是否有問題？ 等候賜教！ 萬分感謝！ |
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winter_gates
金蟲 (正式寫手)
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★
liubin(金幣+1): 2010-09-19 14:44:35
americanyk(金幣+1):謝謝回帖交流 2010-09-19 09:40:00
liubin(金幣+1): 2010-09-19 14:44:35
americanyk(金幣+1):謝謝回帖交流 2010-09-19 09:40:00
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要看你是什么樣品，樣品在緩沖液下是否有電離，如果是SDS-PAGE的話一般樣品是蛋白質(zhì)且表面的電荷是SDS給予的，我做蛋白樣品的時候，一般是設(shè)置電壓，積層膠一般50V20-25min，分離膠一般120V-180V，40min-1.5h。下面是我常用的buffer Tris-tricine電泳緩沖液： Cathode buffer 負(fù)極緩沖液：pH 8.25（可不調(diào)pH） Tris-Hcl 100 mM tricine 100 mM SDS 0.1% 500 ml：6.055g Tris + 8.96g Tricine + 0.5g SDS Anode buffer 正極緩沖液：pH8.9 Tris-Hcl 200 mM 1000 ml：24.22g Tris 額，寫到這，我知道你的問題了，電泳液…… |
3樓2010-09-19 11:21:41
2樓2010-09-19 11:17:11
dj04164
木蟲 (正式寫手)
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4樓2010-09-19 20:58:28
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