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zhangxn2010

木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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[交流] 【求助/交流】連接幾次，仍然不見(jiàn)菌落出現(xiàn)

最近做載體構(gòu)建，很不順。
主要是把酶切后的片段（約2000bp)連到載體上，轉(zhuǎn)化后總是沒(méi)有菌落出現(xiàn)。
前些天相同的位置連了另一條片段出現(xiàn)了很多克隆，測(cè)序也是對(duì)的，現(xiàn)在真是很迷茫（感態(tài)應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題，因?yàn)橛玫耐慌�；T4Ligase應(yīng)該也沒(méi)問(wèn)題）

[ Last edited by zhangxn2010 on 2010-12-4 at 09:37 ]

PS:本帖中問(wèn)題已在2011年解決，當(dāng)時(shí)沒(méi)有放上具體原因，現(xiàn)做說(shuō)明，以對(duì)有相關(guān)問(wèn)題的蟲(chóng)友有啟發(fā)。
用相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間排除，最后在電泳液上找出了問(wèn)題，第一個(gè)載體構(gòu)建完之前一直選用TAE做緩沖液，后來(lái)一個(gè)剛來(lái)的海歸博士建議用TBE（理由當(dāng)然是條帶清楚之類(lèi)的），噩夢(mèng)就開(kāi)始了，原來(lái)是TBE和膠回收試劑盒有沖突，造成回收產(chǎn)物不能進(jìn)行連接。
希望蟲(chóng)子們多注意小細(xì)節(jié)，我因?yàn)檫@點(diǎn)失誤耽誤近兩月，領(lǐng)導(dǎo)眼都快綠了（當(dāng)然還有其他并行工作，否則直接被炒掉了）。

[ Last edited by zhangxn2010 on 2012-12-11 at 15:10 ]

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1樓 2010-12-04 08:25:19

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飛俠8683

新蟲(chóng) (小有名氣)

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zhangxn2010(金幣+1):我覺(jué)得如果酶切不好的話(huà)，比如沒(méi)切開(kāi)，載體會(huì)自連，然后也會(huì)出相應(yīng)菌落啊 2010-12-06 12:22:49

有可能是你目的片段酶切效果不好

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5樓2010-12-06 11:36:49

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zhangxn2010

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自己頂一下，希望大家來(lái)討論。

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2樓2010-12-04 09:38:04

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iaminxanadu

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★
silicare(金幣+1):謝謝參與 2010-12-04 10:40:55
zhangxn2010(金幣+2):是個(gè)好辦法，我再試試看 2010-12-04 13:30:10
zhangxn2010(金幣+1): 2010-12-06 11:33:59

你不是已經(jīng)在同一位置連過(guò)了嗎，可以用這個(gè)載體切膠回收后和你的新的片段連接，這時(shí)加大濃度，調(diào)整比例。
當(dāng)然也可能是引物合成錯(cuò)誤，我遇到過(guò)。怎么都連接不上，后來(lái)重合成相同引物就很順利的連上了。

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3樓2010-12-04 10:35:50

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zhangxn2010

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這個(gè)版塊人很多啊，為什么沒(méi)有很多人來(lái)我的帖子，繼續(xù)求助.......

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4樓2010-12-06 11:32:35

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