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老實(shí)人sdu3375木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
【求助】包涵體表達(dá)與可溶性表達(dá)
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| 請(qǐng)大家說(shuō)一下可溶性表達(dá)比包涵體表達(dá)的優(yōu)勢(shì)有哪些？謝謝，最好全面一些哈~ |
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happychick
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老實(shí)人sdu3375(金幣+5): 2011-03-16 19:02:38
qinhy(金幣+2): 說(shuō)的很多，多給2個(gè)金幣獎(jiǎng)勵(lì)下~~歡迎常來(lái)~~ 2011-03-16 19:48:11
老實(shí)人sdu3375(金幣+5): 2011-03-16 19:02:38
qinhy(金幣+2): 說(shuō)的很多，多給2個(gè)金幣獎(jiǎng)勵(lì)下~~歡迎常來(lái)~~ 2011-03-16 19:48:11
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許多外源蛋白在大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)后都是以包涵體形式存在，包涵體是一種致密、不可溶的顆粒。一般情況下，形成包涵體表達(dá)產(chǎn)率都很高，并且容易分離得到比較純的包含體。包涵體致密的結(jié)構(gòu)有助于防止蛋白酶對(duì)它的降解作用，如果毒性較強(qiáng)的蛋白形成包涵體也就不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生太大的損傷。如果做蛋白表達(dá)的目的是為了作為抗原制備抗體，那么出現(xiàn)包涵體也可以，可以用PBS將包涵體懸浮，使用佐劑將溶液乳化后注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫。 包含體的形成分析原因之一在于表達(dá)量過(guò)高，表達(dá)產(chǎn)物來(lái)不及折疊為活性形式—多數(shù)以高表達(dá)見(jiàn)長(zhǎng)的蛋白表達(dá)系統(tǒng)都會(huì)得到包含體產(chǎn)物。如果融合蛋白表達(dá)含有標(biāo)簽，常用的做法是將包涵體用尿素溶解后在變性的情況下進(jìn)行純化，然后復(fù)性。但是，在溶解之前應(yīng)該還要確定一下，蛋白是確實(shí)不可溶還是細(xì)胞裂解不完全。利用相差顯微鏡或者染色后對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行觀察，如果仍可以看到完整的細(xì)胞或者裂解后的沉淀和之前收集細(xì)胞沉淀大小相似，則可能意味著細(xì)胞沒(méi)有被徹底裂解而導(dǎo)致檢測(cè)不到產(chǎn)物。如果形成了包涵體，在比較高倍的（>400×）光鏡下可以觀察到大腸桿菌中有致密的結(jié)構(gòu)。因?yàn)榘w可能會(huì)占據(jù)細(xì)胞一半體積。 如果希望得到能行使功能的蛋白，蛋白應(yīng)該以可溶形式表達(dá)。避免包涵體形成的方法很多，比如：選用表達(dá)量不高的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，選擇有助于可溶性表達(dá)的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)等，使用基本培養(yǎng)基等也有助于可溶性表達(dá)。另外一個(gè)容易忽視的問(wèn)題是大腸桿菌內(nèi)還原性過(guò)高會(huì)導(dǎo)致二硫鍵不能正確形成，同樣容易導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物不溶，更換菌株有助于解決這個(gè)問(wèn)題。 |
2樓2011-03-16 09:44:33
happychick
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4樓2011-03-16 19:03:01
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