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guanjinke銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】PCR 已有7人參與
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各位師兄師姐：PCR擴(kuò)出來(lái)產(chǎn)物的亮度不高。求教這個(gè)問(wèn)題怎么解決？謝謝！  |
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2樓2011-03-08 16:38:54
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3樓2011-03-08 16:48:05
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4樓2011-03-08 16:49:17
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5樓2011-03-08 17:06:54
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6樓2011-03-08 17:14:03
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7樓2011-03-08 17:20:48
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8樓2011-03-08 17:24:05
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樓主說(shuō)得太模糊。 不亮一般是產(chǎn)物濃度低，濃度低緣于PCR效率低，或者是循環(huán)數(shù)太少。影響效率的因素就很多了，常見(jiàn)的是溫度、Mg離子濃度、dNTP濃度、taq酶活性等。但我們一般只調(diào)整退火溫度。退火溫度不是越低產(chǎn)物濃度越高，我們?cè)龅竭^(guò)低了也不亮的情況，這可能是因?yàn)橐镉卸垠w或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)，溫度低了會(huì)降低有效的引物濃度。最后一個(gè)最重要的因素就是引物，有些引物隨便就能擴(kuò)出來(lái)，有些引物做一個(gè)月只能擴(kuò)出一兩次（這種引物很刁鉆，如果不是必須用它，就另外設(shè)計(jì)再做，有時(shí)候移動(dòng)幾個(gè)堿基就非常好擴(kuò)了）。 如果是碰到刁鉆的引物，擴(kuò)了很久擴(kuò)不好，試著調(diào)整一下退火時(shí)間和延伸時(shí)間。我曾有對(duì)刁鉆引物擴(kuò)了快一個(gè)月，總是偶爾能擴(kuò)出，后來(lái)一怒之下，將退火時(shí)間從1min改成45s，成了！還有師弟做另一對(duì)引物，延長(zhǎng)延伸時(shí)間30s，帶就濃了。 PCR是個(gè)折磨人的事，慢慢享受吧！還有，別迷信primer premier給出的引物分?jǐn)?shù)，有時(shí)候那完全是浮云。 [ Last edited by yunbfly on 2011-3-8 at 17:44 ] |
9樓2011-03-08 17:39:43
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10樓2011-03-08 17:52:02
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