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[交流] 【求助/交流】做過RT-PCR的請進(jìn)

大家好，我因為新近才換課題，要提mRNA做反轉(zhuǎn)錄，因為實驗室沒有人做過，不知道試驗中應(yīng)該注意什么，還有都要用到什么試劑盒什么酶？請做過的人降一下我也好讓老師早點買試劑盒和酶啊，先謝謝了啊。

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1樓 2011-03-14 09:01:37

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nininini

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houhoujiayou(金幣+5): 謝謝MM了，但是不是很明白，要DNase消化是為什么�。苛硗鉃槭裁凑f“只做反轉(zhuǎn)錄”啊，還有其他的操作目的嗎？我是要把酵母的基因反P出來后做表達(dá)的啊，MM做過的話可以說的詳細(xì)點嗎？謝謝了啊 2011-03-14 09:16:09
lstt09nk(金幣+2): 鼓勵交流 2011-03-14 09:26:11

如果是只做反轉(zhuǎn)錄的話只需要提取RNA、DNase消化和反轉(zhuǎn)錄酶了，根據(jù)實驗室情況RNA提取可以用試劑盒也可以用其它試劑提取，DNase和反轉(zhuǎn)錄酶也都差不多了，找平時經(jīng)常使用試劑的廠家應(yīng)該問題不大了吧，天根、生工什么的應(yīng)該都沒問題吧

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2樓2011-03-14 09:08:21

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houhoujiayou(金幣+3): 這個我聽說過了，說要用什么溶液把所有要用的儀器泡一下，那基本上要買什么試劑盒和酶啊，能把操作步驟詳細(xì)講一下嘛？雖然看過理論，可是實際做起來還是無從下手，咳 2011-03-14 09:25:30

引用回帖:

Originally posted by houhoujiayou at 2011-03-14 09:01:37:
大家好，我因為新近才換課題，要提mRNA做反轉(zhuǎn)錄，因為實驗室沒有人做過，不知道試驗中應(yīng)該注意什么，還有都要用到什么試劑盒什么酶？請做過的人降一下我也好讓老師早點買試劑盒和酶啊，先謝謝了啊。

在提取mRNA中注意他是很容易降解的，自然環(huán)境中都存在著核酸酶，所以提取過程中注意下

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3樓2011-03-14 09:17:55

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Originally posted by nininini at 2011-03-14 09:08:21:
如果是只做反轉(zhuǎn)錄的話只需要提取RNA、DNase消化和反轉(zhuǎn)錄酶了，根據(jù)實驗室情況RNA提取可以用試劑盒也可以用其它試劑提取，DNase和反轉(zhuǎn)錄酶也都差不多了，找平時經(jīng)常使用試劑的廠家應(yīng)該問題不大了吧，天根、生工什么 ...

你是研究什么代謝的，我們課題組也是代謝方向的

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4樓2011-03-14 09:22:28

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Originally posted by weishengsu5 at 2011-03-14 09:22:28:
你是研究什么代謝的，我們課題組也是代謝方向的

我是做一個基因的克隆表達(dá)，之前的課題做不出來，臨時換了一個，具體怎么操作我都不明白，急啊

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5樓2011-03-14 09:27:22

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jiangzhiang

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houhoujiayou(金幣+1): 嗯哪，謝謝了啊，我再看看操作書吧 2011-03-14 10:05:35
houhoujiayou(金幣+1): 2011-03-16 12:01:17

還是沒明白，是從來沒接觸過，還是試驗遇到困難，實在不知道怎么辦先看看分子克隆手冊，或者別人的論文，熟悉下流程，需要什么試劑好說吧，我覺得MBI和TAKALA的不錯

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6樓2011-03-14 09:51:19

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zhaoxianfeng

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silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-03-14 11:50:57
houhoujiayou(金幣+1): 2011-03-16 12:01:22

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1.提RNA，防降解
2.rt，反轉(zhuǎn)RNA得出cDNA
3.用cDNA做模板進(jìn)行PCR，我們用寶生物的試劑盒做的
4.1%電泳檢測，照相。

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7樓2011-03-14 10:37:22

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zhangxn2010

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houhoujiayou(金幣+1): 2011-03-16 12:01:25

這個先得把分子克隆實驗指導(dǎo)看一遍(相關(guān)方面），那樣會比較全面，如果實驗中遇到問題，來這里求助會比較好，祝實驗順利！

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8樓2011-03-14 11:35:14

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houhoujiayou(金幣+1): 2011-03-16 12:01:28

1.提取總RNA，跑膠看一下質(zhì)量
2.RT-PCR，一般用Olig-dT轉(zhuǎn)錄出cDNA（我們用的是東洋舫的盒子）
再進(jìn)行后續(xù)實驗

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9樓2011-03-14 14:39:41

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tingspdf

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houhoujiayou(金幣+1): 2011-03-16 12:01:32

看分子克隆吧，那上面是最全的

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10樓2011-03-14 16:00:41

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Originally posted by weishengsu5 at 2011-03-14 09:22:28:
你是研究什么代謝的，我們課題組也是代謝方向的

我們也差不多啦~

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11樓2011-03-15 17:28:39

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houhoujiayou(金幣+1): 謝謝 2011-03-22 20:57:24

引用回帖:

DNase的目的是進(jìn)一步消化未完全除盡的DNA，如果只是表達(dá)的話不用定量之類的相對要求低一點兒，只要能P出產(chǎn)物就好了~

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12樓2011-03-15 17:31:53

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mxlo.o

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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖

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9樓: Originally posted by 沒有眼淚 at 2011-03-14 14:39:41:
1.提取總RNA，跑膠看一下質(zhì)量
2.RT-PCR，一般用Olig-dT轉(zhuǎn)錄出cDNA（我們用的是東洋舫的盒子）
再進(jìn)行后續(xù)實驗

我用一種真菌提取出RNA后進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄，其中1kb左右的片段提取出來了，但是2kb左右的片段怎么也擴(kuò)增不出來。我的問題是1kb的能擴(kuò)出來是否證明我提取的RNA沒有問題，如果這樣的話，哪2kb的為什么擴(kuò)增不出來？

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13樓2011-12-09 22:19:44

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