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[交流]
【求助/交流】連接轉(zhuǎn)化 已有8人參與
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| 我最近做原核表達(dá)，但是目的片段和質(zhì)粒都雙酶切后連接不成功，不知道是什么問(wèn)題，請(qǐng)各位賜教！ |
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西瓜(金幣+2, EPI+1): 分析得很全面了，贊！ 2011-04-12 23:53:46
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西瓜(金幣+2, EPI+1): 分析得很全面了，贊！ 2011-04-12 23:53:46
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1：質(zhì)粒酶切的是否徹底，還有基因呢？如果酶切的不夠徹底的話，肯定影響連接效率了； 2：你連接體系的設(shè)計(jì)，如果基因和質(zhì)粒的量不合適，也會(huì)影響連接效率滴； 3：連接時(shí)間呢？ 4：篩選過(guò)程，你可以先進(jìn)行PCR驗(yàn)證，然后提取質(zhì)粒酶切進(jìn)行驗(yàn)證。 總之這個(gè)連接轉(zhuǎn)化是分子生物學(xué)最基礎(chǔ)的技術(shù)了，一定得扎實(shí)了，這樣對(duì)于后期實(shí)驗(yàn)有很大幫助。 祝好運(yùn)！ |
2樓2011-04-12 22:23:16
zhaohq1209
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西瓜(金幣+3): 個(gè)人也覺(jué)得雙酶切出問(wèn)題可能性比較大 2011-04-12 23:54:35
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西瓜(金幣+3): 個(gè)人也覺(jué)得雙酶切出問(wèn)題可能性比較大 2011-04-12 23:54:35
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雙酶切有問(wèn)題~ 見(jiàn)帖子http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3062980 |
3樓2011-04-12 22:23:44
xiaoyu1014126
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1.片段和載體的質(zhì)量是首先要保證的。片段注意盡量不要有其他條帶的污染，尤其是小條帶（小條帶的連接效率是遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大條帶的） 2.關(guān)于酶切：限制性內(nèi)切酶對(duì) 線性DNA的切割效率要稍低于環(huán)狀的質(zhì)粒，因此要適當(dāng)延長(zhǎng)PCR片段的酶切時(shí)間；還有PCR產(chǎn)物兩端的酶切位點(diǎn)前有沒(méi)有加足夠的保護(hù)堿基，裸露的酶切位點(diǎn)是無(wú)法酶切的；在進(jìn)行雙酶切時(shí)，載體上如果兩個(gè)酶切位點(diǎn)離得比較近(即切完后無(wú)法通過(guò)跑膠看到切下的小片段)建議不要進(jìn)行一步雙酶切，而是要分步酶切，這樣比較保險(xiǎn)；酶切完后PCR片段可以直接過(guò)柱回收，質(zhì)粒最好割膠回收。 3.關(guān)于連接：只要控制好片段載體的比例，抗性弄不錯(cuò)的話按操作規(guī)程來(lái)是不會(huì)出現(xiàn)什么問(wèn)題的 |
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yu棒棒5樓2011-04-13 13:31:39
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西瓜(金幣+3): 感謝分享經(jīng)驗(yàn) 2011-04-14 11:54:29
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西瓜(金幣+3): 感謝分享經(jīng)驗(yàn) 2011-04-14 11:54:29
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雙酶切連接轉(zhuǎn)化做了好多了，有幾點(diǎn)小小經(jīng)驗(yàn)也分享一下。 1. 雙酶切酶的選擇，如果只能選固定的酶，那根據(jù)公司推薦選擇合適的雙酶切buffer，如果沒(méi)有合適buffer，可進(jìn)行分步酶切。酶切體系一般在30-100ul為宜。如果使用的酶沒(méi)有星號(hào)活性的情況下，適當(dāng)增加酶切時(shí)間。 2. 個(gè)人感覺(jué)在酶切回收過(guò)程中需要注意的地方是膠回收，酶切后應(yīng)盡量避免膠回收，避免紫外照射，我做的時(shí)候一般是克隆質(zhì)粒上或者PCR產(chǎn)物后的插入片段進(jìn)行膠回收，表達(dá)載體酶切后直接沉降，因?yàn)檩d體一般較大，充分酶切打開(kāi)后，短時(shí)間內(nèi)沉降小片段不容易回收，而載體一般都可以回收得到，同時(shí)洗的時(shí)候又可以把小片段洗除。 3. 掌握好插入片段和載體的配比，有公式可以計(jì)算，載體濃度低一點(diǎn)問(wèn)題不大。 也可以說(shuō)一下你的詳細(xì)步驟，大家再討論 |
6樓2011-04-14 03:13:55
7樓2011-04-14 11:04:22
alice
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8樓2011-12-03 16:13:29
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9樓2012-06-18 21:26:20
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老師，您好！ 看了您的經(jīng)驗(yàn)，我對(duì)第二條不是很明白，您的意思是表達(dá)載體酶切后不要回收么？可是您后來(lái)解釋說(shuō)載體一般可以回收得到，是什么意思？ 今天我第一次做雙酶切，酶切后跑膠，看到酶切效果不錯(cuò)，然后我做了膠回收，可是克隆質(zhì)粒上切下的插入片段回收到了，表達(dá)載體的卻沒(méi)有回收到。老師，我不應(yīng)該將表達(dá)載體做膠回收么？ 初次接觸這一塊，有很多問(wèn)題，想懇請(qǐng)老師批評(píng)指正。謝謝！ |
10樓2012-06-18 21:33:10
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