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youngsun50木蟲 (正式寫手)
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[求助]
原核表達(dá)標(biāo)簽的切除，及信號(hào)肽的影響
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請(qǐng)問(wèn)高手，我的蛋白序列（G-細(xì)菌的）預(yù)測(cè)著在前28位為信號(hào)肽，可能分泌到周質(zhì)中發(fā)揮作用，請(qǐng)問(wèn)： 1）如果要做酶動(dòng)力學(xué)及用此純化蛋白（酶）體外反應(yīng)體系篩化合物，要不要把信號(hào)肽去掉，即直接表達(dá)的蛋白序列為（29-后）。若表達(dá)全序列，信號(hào)肽對(duì)酶動(dòng)力及蛋白結(jié)構(gòu)影響大嗎？ 2）要去掉his-tag（雜志要求的），一般用啥酶切好，能夠盡可能甚至無(wú)剩余氨基酸，而且酶切效率高，及酶切時(shí)目的蛋白損失少，蛋白酶好去除。請(qǐng)推薦蛋白酶及相應(yīng)載體。 謝謝  |
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 【分子生物】EPI帖 |
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lxj341401
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4樓2011-05-17 10:32:36
lxj341401
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-05-17 08:39:11
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-05-17 08:39:11
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1、信號(hào)肽未切割影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)，也影響蛋白的性質(zhì)，包括活性，異源表達(dá)一般是表達(dá)成熟肽部分的，因?yàn)樵瓉?lái)的信號(hào)肽不能被識(shí)別和切割。 2、用腸激酶EK，切割后無(wú)剩余氨基酸，構(gòu)建融合基因時(shí)把his-tag編碼序列加5‘端，然后腸激酶酶切位點(diǎn)（DDDDK）編碼序列，再后面就是你的成熟肽編碼序列，表達(dá)后就是his-tag-DDDDK-成熟肽，酶切在K后面，得到無(wú)剩余氨基酸的成熟肽，沒切割或者切割剩下的his-tag-DDDDK可以親和層析去除。 |
2樓2011-05-17 07:43:13
youngsun50
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5樓2012-09-21 14:30:13
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