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PCR跑不出目的片段
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用beacon designer7.9設(shè)計了4對引物，分2次送出合成。就是跑不出片段。片段大分別是：571、699、626、652bp。 我換了DEPC水，重新提了RNA，跑了溫度梯度，引物梯度，模板梯度，還用他人用的正常的cDNA跑，都不行，沒有目得片段，但有引物二聚體。內(nèi)參-action能跑出來，很亮，測了提取的RNA OD值，各項正常。 我跑的基因mRNA序列2525bp，有3個外顯子，CDS區(qū)在第三個外顯子里，前兩個外顯子片段很短，共388bp。我設(shè)計的引物上游在前兩個外顯子里，下游在第三個外顯子里。另外，我開始在CDS區(qū)（第三個外顯子里）設(shè)計的引物都跑出來了，很好。 引物稀釋沒問題，我跟內(nèi)參一起稀釋的，并且我有2管，都稀釋了，都泡了PCR。 引物各種參數(shù)都正常，軟件評分都很高。就是有的個別引物的錯配有點高，但3和5端沒有錯配。 [ Last edited by zsdk on 2011-5-19 at 09:31 ] |
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2樓2011-05-19 11:56:45
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3樓2011-05-19 13:52:32
4樓2011-05-19 14:20:10
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
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1949stone(金幣+5): 同意 2011-05-19 18:02:38
zsdk(金幣+4): 2011-05-21 20:05:02
1949stone(金幣+5): 同意 2011-05-19 18:02:38
zsdk(金幣+4): 2011-05-21 20:05:02
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actin能跑出來，說明cDNA沒問題，之前的反轉(zhuǎn)錄以及RNA提取也沒問題。考慮引物設(shè)計的問題吧。 引物設(shè)計一般都設(shè)計成沒有錯配的（軟件分析結(jié)果），你這個是有特殊用處嗎？ 你PCR是用來做什么的？擴增基因，還是熒光定量PCR或者別的？ [ Last edited by 西瓜 on 2011-5-21 at 22:13 ] |
5樓2011-05-19 16:34:38
6樓2011-05-21 20:04:54
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7樓2011-05-21 22:15:37
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