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jayxj鐵桿木蟲 (小有名氣)
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pMG36e 構(gòu)建的奇怪現(xiàn)象
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質(zhì)粒構(gòu)建在我們實驗室已是常規(guī)操作，但是最近構(gòu)建pMG36e時出現(xiàn)一個奇怪的問題： 轉(zhuǎn)化后，在紅霉素（200ug/ml）篩選LB培養(yǎng)基上，要么沒有菌落，要么長出的菌落擴(kuò)大后提不出質(zhì)粒。（菌體抗藥性突變？也太頻繁了吧？幾十個克隆都這樣） 請各位幫忙分析下原因。 目的基因長度：1000~2000bp（幾個基因）此載體也曾連上過300bp和2500bp的片段。 酶切位點：SacI和HindIII 感受態(tài)：全式金DH5a、自制高效感受態(tài)，已驗證 質(zhì)粒提取試劑盒：生工和鼎國小提試劑盒，已驗證 連接酶：TaKaRa Solution I 和 T4連接酶，已驗證 連接接比例：質(zhì)粒:目的基因=1:4~1:10 連接時間：12~16小時 以上條件、試劑連接大腸桿菌載體（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出現(xiàn)問題。 |
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其實個人覺得樓主說的：以上條件、試劑連接大腸桿菌載體（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出現(xiàn)問題；給這些載體克隆基因沒有問題并不見得給你的那個載體克隆也沒有問題嘛，這不問題出現(xiàn)了嗎？ 克隆一個基因其實個人覺得關(guān)鍵在于連接和感受態(tài)細(xì)胞。。。按照你上面所述，連接體系應(yīng)該也不會出現(xiàn)什么問題，連接時間可以稍微短一些，7小時---10小時試試。。。 另外抗生素有沒有問題呢？濃度會不會太大了？ 你的載體和基因酶切是否完全？如果酶切不完全，也會影響你后期的連接的。。。 可以變換體系再試試。。。 |
2樓2011-05-24 19:54:46
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3樓2011-05-25 16:15:31
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5樓2011-05-26 18:47:03
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7樓2011-06-08 10:52:40
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用陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，提取質(zhì)粒沒有什么問題。只是在連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，經(jīng)常碰到你所說的現(xiàn)象。解決方式是先做菌落PCR確定含有質(zhì)粒后在對其實施提取質(zhì)粒的操作，培養(yǎng)時間16-19h，一般用小提試劑盒提�。�9ml菌液處理后，過一個柱子，用30-60ul溶液洗脫），常規(guī)堿裂解提取質(zhì)粒，往往200ml起提，最后溶在50ulTER里。估計你用的是堿裂解法，菌液量也不夠，pMG36e拷貝數(shù)不高，菌液少了很難提出來，試試試劑盒。 |
8樓2011-06-09 14:53:17
wangzhou79
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