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jayxj鐵桿木蟲 (小有名氣)
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pMG36e 構(gòu)建的奇怪現(xiàn)象
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質(zhì)粒構(gòu)建在我們實(shí)驗(yàn)室已是常規(guī)操作，但是最近構(gòu)建pMG36e時(shí)出現(xiàn)一個(gè)奇怪的問題： 轉(zhuǎn)化后，在紅霉素（200ug/ml）篩選LB培養(yǎng)基上，要么沒有菌落，要么長(zhǎng)出的菌落擴(kuò)大后提不出質(zhì)粒。（菌體抗藥性突變？也太頻繁了吧？幾十個(gè)克隆都這樣） 請(qǐng)各位幫忙分析下原因。 目的基因長(zhǎng)度：1000~2000bp（幾個(gè)基因）此載體也曾連上過300bp和2500bp的片段。 酶切位點(diǎn)：SacI和HindIII 感受態(tài)：全式金DH5a、自制高效感受態(tài)，已驗(yàn)證 質(zhì)粒提取試劑盒：生工和鼎國(guó)小提試劑盒，已驗(yàn)證 連接酶：TaKaRa Solution I 和 T4連接酶，已驗(yàn)證 連接接比例：質(zhì)粒:目的基因=1:4~1:10 連接時(shí)間：12~16小時(shí) 以上條件、試劑連接大腸桿菌載體（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出現(xiàn)問題。 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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wangzhou79
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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7樓2011-06-08 10:52:40
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【答案】應(yīng)助回帖
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jayxj(金幣+5): 非常感謝 2011-05-25 16:16:54
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其實(shí)個(gè)人覺得樓主說的：以上條件、試劑連接大腸桿菌載體（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出現(xiàn)問題；給這些載體克隆基因沒有問題并不見得給你的那個(gè)載體克隆也沒有問題嘛，這不問題出現(xiàn)了嗎？ 克隆一個(gè)基因其實(shí)個(gè)人覺得關(guān)鍵在于連接和感受態(tài)細(xì)胞。。。按照你上面所述，連接體系應(yīng)該也不會(huì)出現(xiàn)什么問題，連接時(shí)間可以稍微短一些，7小時(shí)---10小時(shí)試試。。。 另外抗生素有沒有問題呢？濃度會(huì)不會(huì)太大了？ 你的載體和基因酶切是否完全？如果酶切不完全，也會(huì)影響你后期的連接的。。。 可以變換體系再試試。。。 |
2樓2011-05-24 19:54:46
jayxj
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3樓2011-05-25 16:15:31
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4樓2011-05-25 16:23:06
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