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nininini銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于real-time PCR溫度優(yōu)化的問題
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| 第一次實(shí)驗(yàn)溫度Tm=58度，Cp值22左右，后來相同體系，Tm=66度，結(jié)果Cp值降到了9左右，三四個(gè)基因都是這樣，請(qǐng)問這是什么原因呢，結(jié)果可靠嗎？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
nininini(金幣+3): 2011-05-28 17:53:29
nininini(金幣+1): 2011-07-18 08:51:46
nininini(金幣+1): 2011-07-18 08:51:46
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你的意思是同一基因，同一體系，只是退火溫度不同。CT值差了10以上對(duì)吧？ 那你這個(gè)肯定有問題。3.3個(gè)CT基本就是模板量差10倍。 你是探針法還是染料法。確定沒有副產(chǎn)物吧? CT差10有可能是產(chǎn)物和引物二聚體的差別。 建議你換2步法P下。 95°5s 66°30s 看下。 你的引物退火溫度多少？為什么要選這兩個(gè)溫度？如果你要摸條件，那就直接做個(gè)梯度，你這樣2個(gè)溫度做下來沒意義。 強(qiáng)烈建議做個(gè)NTC組，確認(rèn)下2種溫度下的產(chǎn)物，看有沒有非特異性產(chǎn)物。 |
7樓2011-05-28 16:36:26
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【答案】應(yīng)助回帖
nininini(金幣+5): 謝謝詳細(xì)回復(fù) 2011-05-28 11:35:00
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感覺Cp=22太高了。 雖然Cp值多少都是現(xiàn)實(shí)情況的反應(yīng)。跟Cp有關(guān)的因素其實(shí)也就是PCR反應(yīng)產(chǎn)物量的影響因素。比如:模板量，擴(kuò)增效率等。也就是說Cp和產(chǎn)物的量相關(guān)。 而Tm主要和精度有關(guān)（當(dāng)然也會(huì)影響擴(kuò)增效率以及擴(kuò)增），但在熒光定量PCR中我們調(diào)節(jié)Tm是為了更單一的產(chǎn)物，特別是在用染料法的時(shí)候。也就是說Tm和精度有關(guān)。 你前后實(shí)驗(yàn)都有重復(fù)試過嗎？如果都是相同條件只是Tm不同且是在有一定重復(fù)性下得到的可信結(jié)果。 那我覺得你要做： 1.擴(kuò)增效率考證。。做一個(gè)在不同溫度下的擴(kuò)增效率對(duì)比。 2.試劑確定沒問題。 3.程序設(shè)置與試劑相符合。有些公司酶是要熱變性，有些快速酶，有些是標(biāo)準(zhǔn)酶。 4.擴(kuò)大體系，抬高平臺(tái)期和基線期距離，看看與原體系差別。理論上CT值是一樣的。 5.看是否有背景污染。用水做對(duì)照。 個(gè)人感覺，只是Tm變，Cp差太大了，應(yīng)該是擴(kuò)增效率差別很大造成的。 另外： 1.CT差別有多大？ 2.你是兩步法還是三步法PCR？ 你的情況我沒遇到過。順便學(xué)習(xí)。 |
2樓2011-05-28 11:24:30
nininini
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3樓2011-05-28 11:38:23
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4樓2011-05-28 11:41:31
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