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蛋白表達(dá)糾結(jié)啊
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| 最近做克隆表達(dá)前面克隆步驟都成功，目的基因大小為1.3kb，最后酶切、測序也沒問題，可就是看不到有蛋白表達(dá)，載體PET28，宿主菌是rosetta,已試了25℃、0.4mM IPTG，1mM IPTG 的濃度，30℃、1mM IPTG 兩種條件，請問有必要再試其它誘導(dǎo)條件如37℃或20 ℃過夜？還是果斷的換載體？菌株？還是有其它什么好的辦法？盼聆聽?wèi)?zhàn)友高見！謝謝 |
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yabxxh
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:38
li1977li(金幣+1): 2011-05-31 08:37:20
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:38
li1977li(金幣+1): 2011-05-31 08:37:20
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你才試了兩個組合就說沒有蛋白表達(dá)?請問你是怎么判定沒有蛋白表達(dá)的，sds電泳？是的話你是否分別跑了上清和沉淀？如果都跑了，都沒有的話，建議： 1.按照0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2的IPTG濃度分別在30度和37度誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間從1h，2h，3h，4h做梯度， 2.看你的基因是不是表達(dá)出毒性蛋白，是的話要選擇相應(yīng)的毒性蛋白表達(dá)菌株 3.載體不用換，蛋白表達(dá)不是很復(fù)雜，但是也不是你想的那么簡單，建議多看看《分子克隆第三版》第十五章，希望我沒記錯。 好運(yùn) |
2樓2011-05-30 22:03:45
brightfuture01
木蟲之王 (文壇精英)
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:49
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:49
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首先先發(fā)表一個不同于樓上的看法：蛋白表達(dá)雖操作不復(fù)雜，但絕對不簡單，每個蛋白都是一個個例。 我們組的一個蛋白做了數(shù)百個截短，不同的載體，宿主。大腸、酵母、昆蟲等表達(dá)系統(tǒng)都試了，N多人投入，N多錢投入，兩年了，連可溶性表達(dá)都沒有獲得。 濃度及時間什么的基本可以不試，每次試誘導(dǎo)16、25、37三個溫度，都用0.1mM IPTG，沒有表達(dá)的話基本上就可以不用篩這兩個條件了。再篩也不會有什么表達(dá)。 不知道你的蛋白含不含稀有密碼子，但是我建議你還是多換幾個載體，宿主。果斷點(diǎn)，別猶豫。換個GST標(biāo)簽的，C端His tag的，BL21試過了么？ 毒性不毒性的就不用太在意了，如果毒性能夠抑制的話，你能轉(zhuǎn)化成功都是個問題。我碰到過一個雙突變的例子，怎么轉(zhuǎn)怎么不長，最后在葡萄糖培養(yǎng)基上長出來的。 |
3樓2011-05-31 00:42:50
4樓2011-05-31 08:02:17
5樓2011-05-31 08:04:03
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