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mmojf

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[求助] 關(guān)于RNA以及cDNA電泳問(wèn)題，拜求各位大俠指點(diǎn)

蝦米我實(shí)驗(yàn)的目的是先提取RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行

PCR以獲取目的片段。實(shí)驗(yàn)材料為細(xì)菌，提取RNA 后進(jìn)行紫外分光進(jìn)行檢測(cè)濃度，

濃度比較高，260與280的OD比值也符合實(shí)驗(yàn)要求。但是反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR無(wú)條

帶，高手指點(diǎn)后對(duì)RNA進(jìn)行電泳，電泳無(wú)條帶，同時(shí)Marker有條帶，證明是可能是

RNA問(wèn)題，個(gè)人總結(jié)認(rèn)為是RNA發(fā)生降解，但不知道其降解過(guò)程發(fā)生在電泳過(guò)程中

還是保存過(guò)程中，提RNA完全按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，而且不明白R(shí)NA濃度高但電泳無(wú)條

帶的原理，就是濃度與完整性的關(guān)系。另外，如果出現(xiàn)這樣的問(wèn)題，應(yīng)該如何避

免，蝦米還應(yīng)該如何操作？另附RNA和cDNA電泳圖兩張，請(qǐng)大俠指教！我的全部身

家就兩個(gè)金幣了……全都給你了……雖然不多……

PS:問(wèn)題基本如下 1 電泳無(wú)條帶原因
2 RNA濃度與其完整性關(guān)系
3 出現(xiàn)問(wèn)題，如何解決

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1樓 2011-06-09 22:13:17

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silicare(金幣+6, EPI+1): 2011-06-10 12:22:39

我也深受這個(gè)問(wèn)題困擾。后來(lái)我做了一系列降解實(shí)驗(yàn)（故意在一些環(huán)節(jié)出問(wèn)題，看RNA提取情況）。
相信我，過(guò)程都是平行重復(fù)3次。有空我會(huì)把整個(gè)實(shí)驗(yàn)發(fā)出來(lái)。
這里直接說(shuō)結(jié)果吧：
1.RNA幾乎不會(huì)在電泳過(guò)程中降解，無(wú)論是放了很久的膠，還是很久沒(méi)換水的電泳液。
2.OD比值只能大概參考。因?yàn)椋?60和280不知有RNA會(huì)吸收，還有很多其他物質(zhì)。最后這個(gè)比值可能是許多原因綜合的結(jié)果。
3.就是RNA部分降解也能反轉(zhuǎn)，PCR驗(yàn)證基本也沒(méi)問(wèn)題。

另外，你的圖沒(méi)發(fā)上。具體情況沒(méi)發(fā)分析。
總之我的建議：
1.RNA提取的要點(diǎn)是選對(duì)方法，什么組織用什么方法（網(wǎng)上一堆方法，也有很多kit賣）。方法對(duì)了肯定能提出來(lái)，最多操作不好有部分降解。
2.操作嘛盡量快。
3.反轉(zhuǎn)錄的管子干凈，很多降解發(fā)生在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。但我的實(shí)驗(yàn)從沒(méi)出現(xiàn)過(guò)。
4.所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。是否3次都提不出來(lái)？3次都反轉(zhuǎn)沒(méi)結(jié)果？有重復(fù)性的失敗才有討論價(jià)值。
5.最后，RNA提取真的只是個(gè)非常小而簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)，試劑是最重要的，不是怕污染而是怕過(guò)期！我用自來(lái)水溶RNA一樣條帶完整

（我當(dāng)時(shí)也被雷到）。

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3樓2011-06-09 22:44:21

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yabxxh

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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圖捏，OD值是多少，你跑RNA點(diǎn)用的時(shí)候用的什么loading，什么槍頭，電泳液換了沒(méi)。雖然RNA很堅(jiān)強(qiáng)，但是碰到RNAse A還是極端的脆弱，不會(huì)是在跑的時(shí)候全降解了吧，以經(jīng)驗(yàn)來(lái)說(shuō)是不會(huì)的，除非你真的什么都沒(méi)有提取出來(lái)�？匆幌聢D，應(yīng)該會(huì)更好點(diǎn)

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2樓2011-06-09 22:35:28

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mmojf

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前兩個(gè)都是RNA，第三個(gè)是cDNA，昨天沒(méi)有成功上傳圖片，不好意思了！

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4樓2011-06-10 22:39:41

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我不會(huì)直接傳圖上來(lái)……丟人

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5樓2011-06-10 22:41:32

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Originally posted by yabxxh at 2011-06-09 22:35:28:
圖捏，OD值是多少，你跑RNA點(diǎn)用的時(shí)候用的什么loading，什么槍頭，電泳液換了沒(méi)。雖然RNA很堅(jiān)強(qiáng)，但是碰到RNAse A還是極端的脆弱，不會(huì)是在跑的時(shí)候全降解了吧，以經(jīng)驗(yàn)來(lái)說(shuō)是不會(huì)的，除非你真的什么都沒(méi)有提取出來(lái) ...

你好，謝謝你的回復(fù)，圖片我沒(méi)發(fā)成功，OD值均在1.50--1.69之間；跑RNA時(shí)5倍Buffer 和6 倍Buffer都用過(guò)，均無(wú)條帶；槍頭是進(jìn)口無(wú)RNA酶槍頭；電泳液使用過(guò)老電泳液和新電泳液，但均無(wú)條帶。

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6樓2011-06-10 22:45:39

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Originally posted by adslye at 2011-06-09 22:44:21:
我也深受這個(gè)問(wèn)題困擾。后來(lái)我做了一系列降解實(shí)驗(yàn)（故意在一些環(huán)節(jié)出問(wèn)題，看RNA提取情況）。
相信我，過(guò)程都是平行重復(fù)3次。有空我會(huì)把整個(gè)實(shí)驗(yàn)發(fā)出來(lái)。
這里直接說(shuō)結(jié)果吧：
1.RNA幾乎不會(huì)在電泳過(guò)程中降解， ...

你好，謝謝你的回答，提取RNA的試劑都是新的并經(jīng)過(guò)DEPC處理過(guò)，實(shí)驗(yàn)器材也是；由于提取材料為細(xì)菌，按照懸浮細(xì)胞進(jìn)行的操作，不知道是不是在這里出問(wèn)題；另外RNA提取了3次，反轉(zhuǎn)錄兩次，均無(wú)結(jié)果，不知道是否有分析價(jià)值；反轉(zhuǎn)錄管子可確保干凈，但是操作過(guò)程有點(diǎn)慢，而且實(shí)驗(yàn)室溫度有點(diǎn)高，這個(gè)是否也會(huì)影響結(jié)果？另外，五體投地的佩服你的自來(lái)水��！真的！

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7樓2011-06-10 22:53:24

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★ ★ ★ ★ ★ ★
mmojf(金幣+2): 其實(shí)不會(huì)說(shuō)什么的，謝謝你啦，這倒是真的。 2011-06-11 21:29:26
lstt09nk(金幣+6): 很熱心 2011-06-12 19:03:12

引用回帖:

Originally posted by mmojf at 2011-06-10 22:53:24:
你好，謝謝你的回答，提取RNA的試劑都是新的并經(jīng)過(guò)DEPC處理過(guò)，實(shí)驗(yàn)器材也是；由于提取材料為細(xì)菌，按照懸浮細(xì)胞進(jìn)行的操作，不知道是不是在這里出問(wèn)題；另外RNA提取了3次，反轉(zhuǎn)錄兩次，均無(wú)結(jié)果，不知道是否有 ...

只要是實(shí)驗(yàn)室的成熟技術(shù)那就肯定沒(méi)問(wèn)題。以前實(shí)驗(yàn)室是否也是用這個(gè)方法提取細(xì)菌的RNA？如果是，那應(yīng)該是試劑的問(wèn)題（有沒(méi)有過(guò)期？RNAse污染問(wèn)題不大）。手法應(yīng)該不會(huì)出錯(cuò)。
如果是自己摸索的，那嘗試換一個(gè)新方法。我包括我們實(shí)驗(yàn)室碰到過(guò)的RNA總是提取不出來(lái)都是因?yàn)榉椒ú粚?duì)。比方說(shuō)組織生長(zhǎng)的不同階段，一些代謝產(chǎn)物含量會(huì)變化，而一些成分恰是影響RNA提取的因素。

因此，我的建議，保證材料沒(méi)問(wèn)題的前提。換幾種方法試試，基本也就提取液不同。可能比你一直摸條件找原因節(jié)約時(shí)間。個(gè)人認(rèn)為在這種實(shí)驗(yàn)上浪費(fèi)時(shí)間很不劃算。還不如請(qǐng)實(shí)驗(yàn)室某人吃個(gè)飯，讓他幫你提一次看看。

祝好運(yùn)，有時(shí)候?qū)嶒?yàn)就是這樣，近水樓臺(tái)，空見(jiàn)月！

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8樓2011-06-11 21:13:52

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cfynocry

9樓2012-04-11 23:08:34

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soffy0214

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我馬上也要做了，提前準(zhǔn)備！

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上帝關(guān)上一扇門，就會(huì)打開(kāi)一扇窗。

10樓2012-07-02 14:28:44

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