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yoyoyoyo3985

金蟲(chóng) (小有名氣)

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[交流] 雙酶切連接表達(dá)載體，兩個(gè)月都沒(méi)做出來(lái)，問(wèn)題到底出在哪里呢~？求指點(diǎn) 已有25人參與

我現(xiàn)在在做一個(gè)基因的昆蟲(chóng)表達(dá)，表達(dá)載體是用的是pFast HT A（載體有4850bp）。我的基因目前上到了PMD18-T的載體上，帶酶切位點(diǎn)，已經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證了，基因和酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基都是完整正確的，內(nèi)切酶用得是Hind III 和Spe I
酶切回收的片段和載體質(zhì)量都還不錯(cuò)，條帶明亮單一，濃度約為50ng/ul
反復(fù)做了好多次，T4連接酶過(guò)夜連接做轉(zhuǎn)化，都是不長(zhǎng)斑。
隱形對(duì)照加的酶切后的空載體，陽(yáng)性對(duì)照用得是未酶切的載體，結(jié)果也沒(méi)問(wèn)題。
T4連接酶買(mǎi)的新的，感受態(tài)也是新的。
那么我的問(wèn)題到底出在哪里呢？
求高手指點(diǎn)。非常感謝，現(xiàn)在做的都快吐了……

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1樓 2011-06-22 10:03:09

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sunningheart

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我做的也一直不長(zhǎng)斑，找不出原因。

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33樓2012-08-30 10:24:56

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peace12039088

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西瓜(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2011-06-28 18:39:43

這樣的問(wèn)題建議做電轉(zhuǎn)化，效率會(huì)高些。此外目標(biāo)片段與目標(biāo)載體的比例不一定非要按照理論比例，可以依據(jù)回收后的電泳檢測(cè)結(jié)果來(lái)加入，這樣可能有點(diǎn)不科學(xué)，但我每次都是這樣做出來(lái)的。還有就是電泳顯示的同樣亮度的大小不同片段，片段大的濃度低，片段小的濃度高。

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21樓2011-06-27 11:09:42

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wangmin2010

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我也遇到了類(lèi)似的情況，轉(zhuǎn)空載體時(shí)能長(zhǎng)菌，但轉(zhuǎn)連接產(chǎn)物時(shí)，平板上什么也不長(zhǎng)，目前不知道原因，十分煩呀！

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34樓2012-08-31 22:04:40

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天使托

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amisking: 2011-06-22 18:50:37

怎么看的那么糊涂？還是我智商有問(wèn)題？
樓主是不是想把PMD載體上的一段雙酶切下來(lái)然后連接至pFast HT A上進(jìn)行表達(dá)呢？

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2樓2011-06-22 10:06:56

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yoyoyoyo3985

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引用回帖:

Originally posted by 天使托 at 2011-06-22 10:06:56:
怎么看的那么糊涂？還是我智商有問(wèn)題？
樓主是不是想把PMD載體上的一段雙酶切下來(lái)然后連接至pFast HT A上進(jìn)行表達(dá)呢？

是的呢

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3樓2011-06-22 10:13:03

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garry86

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西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-06-22 16:51:41

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4樓2011-06-22 10:21:34

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amisking(金幣+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-06-22 18:50:46
1949stone(金幣+1): 繼續(xù)鼓勵(lì) 2011-06-27 12:36:30

引用回帖:

Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2011-06-22 10:03:09:
我現(xiàn)在在做一個(gè)基因的昆蟲(chóng)表達(dá)，表達(dá)載體是用的是pFast HT A（載體有4850bp）。我的基因目前上到了PMD18-T的載體上，帶酶切位點(diǎn)，已經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證了，基因和酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基都是完整正確的，內(nèi)切酶用得是Hind III ...

1:你現(xiàn)在有沒(méi)有將那一段雙酶切下來(lái)？
2：還是酶切下來(lái)了，但是一直連接不上？酶切位點(diǎn)對(duì)不對(duì)？
3：你連接轉(zhuǎn)化最后涂布是用什么篩選的？

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5樓2011-06-22 10:24:32

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Originally posted by 天使托 at 2011-06-22 10:24:32:
1:你現(xiàn)在有沒(méi)有將那一段雙酶切下來(lái)？
2：還是酶切下來(lái)了，但是一直連接不上？酶切位點(diǎn)對(duì)不對(duì)？
3：你連接轉(zhuǎn)化最后涂布是用什么篩選的？

已經(jīng)切下來(lái)了，一直連接不上，酶切位點(diǎn)沒(méi)錯(cuò)，片段大小事吻合的
抗性是amp的
空載體轉(zhuǎn)化的感受態(tài)可以長(zhǎng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)不出來(lái)~

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6樓2011-06-22 10:26:59

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Originally posted by garry86 at 2011-06-22 10:21:34:
pFast HT A表達(dá)載體沒(méi)使用過(guò)~ 至少保證載體上有Hind III 和Spe I兩個(gè)位點(diǎn)吧，酶切之后要確保載體和片段都被切開(kāi)了，切膠回收的是正確的片段，然后檢查連接體系正確與否~ 連接片段最少需要0.3pmol 載體需要0.0 ...

祝好運(yùn)啊，我一直沒(méi)做出來(lái)，煩呢

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7樓2011-06-22 10:27:41

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蚊在江湖

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西瓜(金幣+3): 歡迎交流 2011-06-22 16:52:08

考慮點(diǎn)其他原因

我曾經(jīng)做了幾個(gè)月沒(méi)有做出來(lái)，結(jié)果是抗生素出了問(wèn)題

試劑公司貼的是青霉素的標(biāo)簽，結(jié)果不是。

建議都借別人已成功的實(shí)驗(yàn)材料或者做成功了的同學(xué)幫你做，試試看。

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8樓2011-06-22 10:56:05

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Originally posted by yoyoyoyo3985 at 2011-06-22 10:26:59:
已經(jīng)切下來(lái)了，一直連接不上，酶切位點(diǎn)沒(méi)錯(cuò)，片段大小事吻合的
抗性是amp的
空載體轉(zhuǎn)化的感受態(tài)可以長(zhǎng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)不出來(lái)~

個(gè)人認(rèn)為是你連接體系的問(wèn)題，不知道你的體系是怎么樣的？
可以將DNA濃度提高一些，是在載體的2-3倍。也可以連接時(shí)間長(zhǎng)一些。。。

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9樓2011-06-22 11:03:29

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Originally posted by 蚊在江湖 at 2011-06-22 10:56:05:
考慮點(diǎn)其他原因

我曾經(jīng)做了幾個(gè)月沒(méi)有做出來(lái)，結(jié)果是抗生素出了問(wèn)題

試劑公司貼的是青霉素的標(biāo)簽，結(jié)果不是。

建議都借別人已成功的實(shí)驗(yàn)材料或者做成功了的同學(xué)幫你做，試試看。

恩，可以試試

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