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happywoheni鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
【求助】基因克隆T載體酶切問(wèn)題等
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求助啊，本人純屬菜鳥，問(wèn)題較多，請(qǐng)大家?guī)蛶兔Γ?br />
1：引物中添加的限制性酶切位點(diǎn)是選擇T載體上有的還是沒(méi)有的？完全不懂！ 2：我做基因克隆，用的上游引物5‘加了BamH1酶切位點(diǎn)，下游引物5’加了EcoR1酶切位點(diǎn),可以用寶生物的pmD-19 T載體嗎？ 3：我現(xiàn)在做pcr產(chǎn)物的純化，想問(wèn)一下，下一步T載體和pcr產(chǎn)物都要經(jīng)過(guò)雙酶切之后，再連接嗎？還是T載體可以不用雙酶切，只是pcr產(chǎn)物雙酶切？還是其他？ 4：pcr產(chǎn)物可以直接雙酶切嗎，酶切緩沖液用哪一種，溫度一個(gè)是30度一個(gè)是37度。 5：如果T載體不用酶切，直接連，酶切鑒定作用是什么？怎么做？用這兩種限制性內(nèi)切酶切嗎？切完之后是不是有很多段？ 5：藍(lán)白斑篩選操作步驟 在線等，急…… |
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2樓2011-07-06 20:32:25
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, EPI+1): 果斷EPI 2011-07-06 23:20:43
西瓜(金幣+5, EPI+1): 果斷EPI 2011-07-06 23:20:43
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引物中選擇的酶切位點(diǎn)最好是在T載體上沒(méi)有的，因?yàn)門載體連接上外源片段，驗(yàn)證正確之后，要雙酶切質(zhì)粒后跑電泳來(lái)回收外源片段。如果載體上有你設(shè)定的酶切位點(diǎn)，那么雙酶切之后就不是只有載體和外源片段兩條帶了，但是如果你能保證不干擾你要回收的外源片段，雙酶切之后你的外源片段還是能與其它條帶分開(kāi)，那么就沒(méi)關(guān)系。 BamH1和EcoR1都是很常用的酶，一般載體上都有的，依照我上面說(shuō)過(guò)的，只要能保證效果就可以。但是如果兩個(gè)酶切位點(diǎn)相距太近，第一個(gè)酶切了之后第二個(gè)酶會(huì)結(jié)合不上去的。 T載體和PCR產(chǎn)物的連接不用雙酶切，因?yàn)門-A連接是利用Taq酶在PCR產(chǎn)物3'末端有加上一個(gè)A的特性，使得Taq酶的PCR產(chǎn)物或經(jīng)過(guò)Taq酶加A的PCR產(chǎn)物，和一個(gè)人工加上一個(gè)3'末端具有1個(gè)T的載體進(jìn)行連接，由于突出末端可以互補(bǔ)，所以不用再進(jìn)行其它酶切就能連接。 pcr產(chǎn)物最好別直接雙酶切嗎，經(jīng)過(guò)回收之后再雙酶切，體系里的其它物質(zhì)會(huì)少一些，但是你的第三個(gè)問(wèn)題解決了，這第四個(gè)問(wèn)題就沒(méi)有必要回答了。 雙酶切驗(yàn)證是不保險(xiǎn)的，最好是送測(cè)序，因?yàn)殡p酶切只能說(shuō)明片段大小，不能知道是否有點(diǎn)突變。 藍(lán)白斑篩選的原理見(jiàn) http://baike.baidu.com/view/961540.htm http://wenku.baidu.com/view/acb85ffbaef8941ea76e05c5.html 看完了就知道怎么做了。 |
4樓2011-07-06 23:09:00
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9樓2012-07-06 16:09:42
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