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happywoheni鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
【求助】基因克隆T載體酶切問題等
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求助啊，本人純屬菜鳥，問題較多，請大家?guī)蛶兔Γ?br />
1：引物中添加的限制性酶切位點是選擇T載體上有的還是沒有的？完全不懂！ 2：我做基因克隆，用的上游引物5‘加了BamH1酶切位點，下游引物5’加了EcoR1酶切位點,可以用寶生物的pmD-19 T載體嗎？ 3：我現(xiàn)在做pcr產(chǎn)物的純化，想問一下，下一步T載體和pcr產(chǎn)物都要經(jīng)過雙酶切之后，再連接嗎？還是T載體可以不用雙酶切，只是pcr產(chǎn)物雙酶切？還是其他？ 4：pcr產(chǎn)物可以直接雙酶切嗎，酶切緩沖液用哪一種，溫度一個是30度一個是37度。 5：如果T載體不用酶切，直接連，酶切鑒定作用是什么？怎么做？用這兩種限制性內(nèi)切酶切嗎？切完之后是不是有很多段？ 5：藍(lán)白斑篩選操作步驟 在線等，急…… |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, EPI+1): 果斷EPI 2011-07-06 23:20:43
西瓜(金幣+5, EPI+1): 果斷EPI 2011-07-06 23:20:43
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引物中選擇的酶切位點最好是在T載體上沒有的，因為T載體連接上外源片段，驗證正確之后，要雙酶切質(zhì)粒后跑電泳來回收外源片段。如果載體上有你設(shè)定的酶切位點，那么雙酶切之后就不是只有載體和外源片段兩條帶了，但是如果你能保證不干擾你要回收的外源片段，雙酶切之后你的外源片段還是能與其它條帶分開，那么就沒關(guān)系。 BamH1和EcoR1都是很常用的酶，一般載體上都有的，依照我上面說過的，只要能保證效果就可以。但是如果兩個酶切位點相距太近，第一個酶切了之后第二個酶會結(jié)合不上去的。 T載體和PCR產(chǎn)物的連接不用雙酶切，因為T-A連接是利用Taq酶在PCR產(chǎn)物3'末端有加上一個A的特性，使得Taq酶的PCR產(chǎn)物或經(jīng)過Taq酶加A的PCR產(chǎn)物，和一個人工加上一個3'末端具有1個T的載體進(jìn)行連接，由于突出末端可以互補(bǔ)，所以不用再進(jìn)行其它酶切就能連接。 pcr產(chǎn)物最好別直接雙酶切嗎，經(jīng)過回收之后再雙酶切，體系里的其它物質(zhì)會少一些，但是你的第三個問題解決了，這第四個問題就沒有必要回答了。 雙酶切驗證是不保險的，最好是送測序，因為雙酶切只能說明片段大小，不能知道是否有點突變。 藍(lán)白斑篩選的原理見 http://baike.baidu.com/view/961540.htm http://wenku.baidu.com/view/acb85ffbaef8941ea76e05c5.html 看完了就知道怎么做了。 |
4樓2011-07-06 23:09:00
friya0910
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2樓2011-07-06 20:32:25
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3樓2011-07-06 22:42:45
amilie030312
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5樓2011-07-06 23:37:36
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