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小木蟲論壇-學術(shù)科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 切口酶用量問題
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bdchengli木蟲 (小有名氣)
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[求助]
切口酶用量問題
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| 我的實驗設計是在發(fā)卡結(jié)構(gòu)的分子信標上設計了兩個酶切位點，為什么我的切口酶用量要非常大才能出現(xiàn)象，是以前用量的4倍甚至更多 |
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bdchengli
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3樓2011-07-22 10:50:40
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西瓜(金幣+5, EPI+1): 個別酶的活力定義不一樣，樓主還需看說明書。 2011-07-22 12:03:36
bdchengli(金幣+5): 2011-07-22 15:55:31
西瓜(金幣+5, EPI+1): 個別酶的活力定義不一樣，樓主還需看說明書。 2011-07-22 12:03:36
bdchengli(金幣+5): 2011-07-22 15:55:31
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內(nèi)切酶的一般用量是1ul酶切大約1ugDNA，當然有些時候需要加大酶的用量： （1）如果DNA內(nèi)含有多個你所要酶切的酶切位點，那么你需要加大用量（道理很簡單，不用解釋） （2）雙酶切時一種酶在公用buffer里面活性在80%一下 （3）經(jīng)以前驗證，這種酶較其他酶活性低的，一般不常用的酶（稀缺一點的）會出現(xiàn)這種情況 |
2樓2011-07-22 10:43:13
zlu520
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4樓2011-07-22 11:03:56
空谷幽風
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【答案】應助回帖
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西瓜(金幣+4): Good！ 2011-07-22 16:53:25
西瓜(金幣+4): Good！ 2011-07-22 16:53:25
| 影響酶切活性的因素有許多，概略的說可分為外因和內(nèi)因。外因是可預見和控制的，如反應條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當、反應體積的選擇以及反應時間的長短等等。內(nèi)因包括位點偏愛性、甲基化底物、底物的構(gòu)象。構(gòu)象的影響主要指切割線性 DNA 和超螺旋 DNA 時的活性，如與切割 lDNA 相比， EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ 需要至少 2.5-10 倍的酶來切割 pBR322 的超螺旋 DNA 。 PaeRTⅠ 與 XhoⅠ 切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果 5' 端為 CT 則 PaeRTⅠ 不能切割。 |
5樓2011-07-22 12:38:35
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