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luolh2004金蟲 (著名寫手)
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[求助]
細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)問題 急�。。。�！
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各位蟲友們好啊，我現(xiàn)在進(jìn)行Balb/c3T3細(xì)胞培養(yǎng)實驗，現(xiàn)在遇到一系列麻煩事，特地向大家請教，謝謝了哦。 1.細(xì)胞培養(yǎng)使用的雙抗溶液（購買的），有效期已經(jīng)過了，還能夠使用嗎？因為沒有注意到，我已經(jīng)用了好長一段時間了。同樣，如果類似R1640和DMEM培養(yǎng)基過期了，是不是就不能繼續(xù)使用了？ 2.近期發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)非常不好，有很多死細(xì)胞，不管是剛復(fù)蘇的細(xì)胞還是已經(jīng)復(fù)蘇一段時間的細(xì)胞，死細(xì)胞都很多。細(xì)胞生長速度沒受什么影響，算是比較正常，就是不知道為什么會有那么多死細(xì)胞，實在是找不出什么原因。 3.我目前正在做hegf表皮細(xì)胞生長因子活性檢測實驗，使用的方法是MTT法，細(xì)胞是Balb/c3T3細(xì)胞，但是每次做的實驗結(jié)果都發(fā)現(xiàn)，加入生長因子樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值沒有維持培養(yǎng)基的高。希望有同樣做這個實驗的蟲友們，給點意見，或者是有機(jī)會大家多多交流下，謝謝了。 MTT實驗我已經(jīng)做了大半年了，中間總是不斷有問題出現(xiàn)，現(xiàn)在還是沒有能完成，非常著急，有做過類似實驗的蟲友們，一定要幫幫我呀，非常感謝了！ |
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7樓2011-07-25 20:59:13
浪人利利
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【答案】應(yīng)助回帖
luolh2004(金幣+15): 非常感謝，我也有點懷疑是凍存的問題。我的是貼壁細(xì)胞，可以把上清去掉，還是謝謝你的回答 2011-07-24 23:54:10
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1、不過期最好了，雙抗過期不很久也沒關(guān)系，培養(yǎng)基最好不要用過期的 2、通過你的描述，個人覺得你凍存的細(xì)胞可能都有問題（或者中間液氮干掉了，沒及時補(bǔ)充） 3、沒怎么理解你的意思 個人建議：細(xì)胞重新復(fù)蘇，培養(yǎng)液重新制取，稍微比平時多加一點血清試試；細(xì)胞有碎片或者死細(xì)胞就及時PBS多洗幾次，勤換培養(yǎng)液；雖然你的意思我沒完全明白，但是MTT法測定時，96孔板我一般都不把培養(yǎng)液倒掉（防止懸浮細(xì)胞倒掉了），直接加MTT、DMSO等處理，然后震蕩后直接測定數(shù)值；以上僅供參考  |
2樓2011-07-23 23:32:10
lw582482481
銅蟲 (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
luolh2004(金幣+20): 謝謝你的回答，對我挺有用處的，建議也很好。 2011-07-24 23:56:12
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1 雙抗過期是沒有問題的。低溫保存適當(dāng)?shù)那闆r下沒有差別。培養(yǎng)基過期的話，如果你買的是液體培養(yǎng)基，建議不要用了。如果是固體粉末自己配培養(yǎng)基，沒有多大問題。 2 復(fù)蘇之后死細(xì)胞過多，這個是你的細(xì)胞狀態(tài)不好。也許是你在細(xì)胞長的過多的時候傳代，這樣不好（雖然沒有養(yǎng)過你這種細(xì)胞）。另外就是可能你細(xì)胞在消化的時候受損嚴(yán)重，會有部分細(xì)胞死亡。而由于你細(xì)胞自身長的速度比較快，整體來說不受影響。 3 mtt不知道是啥？但是關(guān)于你的EGH的測定我想，這個蛋白是分泌型的，你在測數(shù)值的時候是否沒有把胞外的那部分沒有測定呢？ 4 關(guān)于你試驗的問題，你的對照以及實驗組是否完全一致，這個十分重要。二者的細(xì)胞密度以及生長條件之類的都很有影響。 最后，我建議你是在細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整好之后再做吧。因為細(xì)胞死的多，肯定是有問題的。在細(xì)胞生長得最旺盛的時候傳代但是不能過多或者過少。維持2-6d傳一次最好。還有細(xì)胞的消化一定要適當(dāng)。 |
3樓2011-07-24 09:34:26
aegeansyang
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4樓2011-07-24 15:05:09
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