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luolh2004金蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)問(wèn)題 急�。。。�！
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各位蟲(chóng)友們好啊，我現(xiàn)在進(jìn)行Balb/c3T3細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在遇到一系列麻煩事，特地向大家請(qǐng)教，謝謝了哦。 1.細(xì)胞培養(yǎng)使用的雙抗溶液（購(gòu)買(mǎi)的），有效期已經(jīng)過(guò)了，還能夠使用嗎？因?yàn)闆](méi)有注意到，我已經(jīng)用了好長(zhǎng)一段時(shí)間了。同樣，如果類(lèi)似R1640和DMEM培養(yǎng)基過(guò)期了，是不是就不能繼續(xù)使用了？ 2.近期發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)非常不好，有很多死細(xì)胞，不管是剛復(fù)蘇的細(xì)胞還是已經(jīng)復(fù)蘇一段時(shí)間的細(xì)胞，死細(xì)胞都很多。細(xì)胞生長(zhǎng)速度沒(méi)受什么影響，算是比較正常，就是不知道為什么會(huì)有那么多死細(xì)胞，實(shí)在是找不出什么原因。 3.我目前正在做hegf表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，使用的方法是MTT法，細(xì)胞是Balb/c3T3細(xì)胞，但是每次做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都發(fā)現(xiàn)，加入生長(zhǎng)因子樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值沒(méi)有維持培養(yǎng)基的高。希望有同樣做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的蟲(chóng)友們，給點(diǎn)意見(jiàn)，或者是有機(jī)會(huì)大家多多交流下，謝謝了。 MTT實(shí)驗(yàn)我已經(jīng)做了大半年了，中間總是不斷有問(wèn)題出現(xiàn)，現(xiàn)在還是沒(méi)有能完成，非常著急，有做過(guò)類(lèi)似實(shí)驗(yàn)的蟲(chóng)友們，一定要幫幫我呀，非常感謝了！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
luolh2004(金幣+20): 謝謝，說(shuō)的挺有用的 2011-07-25 20:11:51
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1、雙抗過(guò)期影響不大的，只要不污染就行了，但是培液過(guò)期建議最好不用，本人發(fā)現(xiàn)過(guò)期培液容易造成pH不穩(wěn)定，會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成很大影響。 2、我以前也出現(xiàn)過(guò)這樣的問(wèn)題，這應(yīng)該是細(xì)胞自身的關(guān)系，很有可能是細(xì)胞在凍存的時(shí)候出現(xiàn)了問(wèn)題，多傳代幾次后會(huì)慢慢減少。 3、我沒(méi)做過(guò)MTT用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞因子活性的實(shí)驗(yàn)，但是做過(guò)很多檢測(cè)細(xì)胞毒性和殺傷力的實(shí)驗(yàn)，本人覺(jué)得做MTT有以下幾點(diǎn)特別需要注意：1. 加MTT時(shí)注意槍頭不能插到孔底，免得損傷細(xì)胞，2、倒培液是要倒均勻，用槍吸的時(shí)候很容易導(dǎo)致細(xì)胞被吸走或者吸不均勻，我們自創(chuàng)了一種辦法是將96孔板倒置在吸水紙上，再將96空斑傾斜幾次，這樣能比較均勻的吸走培液，效果挺不錯(cuò)。 |
5樓2011-07-25 08:29:48
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| 其他的就不說(shuō)了，我以前本來(lái)也要做MTT的，后來(lái)因?yàn)榭匆?jiàn)有直接的細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞毒性試劑盒，就直接買(mǎi)來(lái)用了，個(gè)人感覺(jué)很好用，當(dāng)時(shí)是買(mǎi)的cck-8試劑盒，同仁化學(xué)研究所（Dojindo Laboratories ）公司的，用起來(lái)比較方便，也不是很貴，當(dāng)然比起MTT試劑是貴了點(diǎn)，呵呵，不知道這對(duì)樓主有沒(méi)有幫助 |
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luolh200411樓2013-03-09 23:10:26
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【答案】應(yīng)助回帖
luolh2004(金幣+15): 非常感謝，我也有點(diǎn)懷疑是凍存的問(wèn)題。我的是貼壁細(xì)胞，可以把上清去掉，還是謝謝你的回答 2011-07-24 23:54:10
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1、不過(guò)期最好了，雙抗過(guò)期不很久也沒(méi)關(guān)系，培養(yǎng)基最好不要用過(guò)期的 2、通過(guò)你的描述，個(gè)人覺(jué)得你凍存的細(xì)胞可能都有問(wèn)題（或者中間液氮干掉了，沒(méi)及時(shí)補(bǔ)充） 3、沒(méi)怎么理解你的意思 個(gè)人建議：細(xì)胞重新復(fù)蘇，培養(yǎng)液重新制取，稍微比平時(shí)多加一點(diǎn)血清試試；細(xì)胞有碎片或者死細(xì)胞就及時(shí)PBS多洗幾次，勤換培養(yǎng)液；雖然你的意思我沒(méi)完全明白，但是MTT法測(cè)定時(shí)，96孔板我一般都不把培養(yǎng)液倒掉（防止懸浮細(xì)胞倒掉了），直接加MTT、DMSO等處理，然后震蕩后直接測(cè)定數(shù)值；以上僅供參考  |
2樓2011-07-23 23:32:10
lw582482481
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【答案】應(yīng)助回帖
luolh2004(金幣+20): 謝謝你的回答，對(duì)我挺有用處的，建議也很好。 2011-07-24 23:56:12
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1 雙抗過(guò)期是沒(méi)有問(wèn)題的。低溫保存適當(dāng)?shù)那闆r下沒(méi)有差別。培養(yǎng)基過(guò)期的話，如果你買(mǎi)的是液體培養(yǎng)基，建議不要用了。如果是固體粉末自己配培養(yǎng)基，沒(méi)有多大問(wèn)題。 2 復(fù)蘇之后死細(xì)胞過(guò)多，這個(gè)是你的細(xì)胞狀態(tài)不好。也許是你在細(xì)胞長(zhǎng)的過(guò)多的時(shí)候傳代，這樣不好（雖然沒(méi)有養(yǎng)過(guò)你這種細(xì)胞）。另外就是可能你細(xì)胞在消化的時(shí)候受損嚴(yán)重，會(huì)有部分細(xì)胞死亡。而由于你細(xì)胞自身長(zhǎng)的速度比較快，整體來(lái)說(shuō)不受影響。 3 mtt不知道是啥？但是關(guān)于你的EGH的測(cè)定我想，這個(gè)蛋白是分泌型的，你在測(cè)數(shù)值的時(shí)候是否沒(méi)有把胞外的那部分沒(méi)有測(cè)定呢？ 4 關(guān)于你試驗(yàn)的問(wèn)題，你的對(duì)照以及實(shí)驗(yàn)組是否完全一致，這個(gè)十分重要。二者的細(xì)胞密度以及生長(zhǎng)條件之類(lèi)的都很有影響。 最后，我建議你是在細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整好之后再做吧。因?yàn)榧?xì)胞死的多，肯定是有問(wèn)題的。在細(xì)胞生長(zhǎng)得最旺盛的時(shí)候傳代但是不能過(guò)多或者過(guò)少。維持2-6d傳一次最好。還有細(xì)胞的消化一定要適當(dāng)。 |
3樓2011-07-24 09:34:26
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luolh2004(金幣+10): 我培養(yǎng)的是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，是貼壁的細(xì)胞，剛復(fù)蘇的時(shí)候死細(xì)胞很多，復(fù)蘇一段時(shí)間后死細(xì)胞就比較少點(diǎn)，但是還是覺(jué)得不正常的，死細(xì)胞比較多點(diǎn) 2011-07-24 23:58:09
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不知你細(xì)胞是接種的時(shí)候就出現(xiàn)大量的不貼壁細(xì)胞呢，還是培養(yǎng)一段時(shí)間后開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞死亡呢？ 如果是前者，可能你的消化過(guò)程存在問(wèn)題；而后者的話可能是培養(yǎng)基有問(wèn)題了 |
4樓2011-07-24 15:05:09
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【答案】應(yīng)助回帖
luolh2004(金幣+15): 謝謝交流回帖，我覺(jué)得你們的意見(jiàn)都很好，可能是我描述太簡(jiǎn)單了，等有機(jī)會(huì)再做個(gè)詳細(xì)描述吧 2011-07-30 10:54:13
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1 雙抗過(guò)期也沒(méi)事的，medium過(guò)期的就別用了 2 就算再好的凍存條件，剛復(fù)蘇的第一代細(xì)胞也必然有很多死的，第二代時(shí)也會(huì)殘留一些。多傳幾代就好了。只要活細(xì)胞生長(zhǎng)速度沒(méi)影響就沒(méi)大問(wèn)題，忍受不了的話就等狀態(tài)好了之后再重新凍存一批好了。 3 MTT的手技要求很高的，個(gè)人感覺(jué)是一個(gè)重復(fù)性較差的實(shí)驗(yàn)方法。你必須保證用于實(shí)驗(yàn)的各組細(xì)胞和各批次細(xì)胞盡量處于同一的狀態(tài)。比如都是從stock中用同樣方式復(fù)蘇同樣代數(shù)的細(xì)胞。而且MTT的幾次換液操作也要盡量統(tǒng)一，盡量快，最好是用排槍。MTT時(shí)盡量不要用整塊96孔板，用中央的25個(gè)左右效果最好。這樣才能盡可能的保證重復(fù)性。至于對(duì)照組和處理組之間的差別，只要重復(fù)性能夠?qū)崿F(xiàn)，你就應(yīng)該尊重實(shí)驗(yàn)事實(shí)，去找可能的原因。 |
8樓2011-07-26 10:11:03
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10樓2012-03-21 14:11:41
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