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rainontime新蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助 雙酶切驗(yàn)證陽性克隆的問題
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本人將某 2600bp的目的基因 和 pet28a載體 雙酶切，切膠回收，T4連接酶4度過夜連接， 將10uL連接產(chǎn)物加到120uL感受態(tài)細(xì)胞中， 加入800uL無抗性培養(yǎng)基 搖菌50分鐘， 涂平板10塊，每塊80uL, 過夜后，發(fā)現(xiàn)只長了一個菌落。。。挑取菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證是否是陽性克隆，切成了兩條片段，發(fā)現(xiàn)其中較短的那條片段比目的片段長！�。。。。。≌垎栠@是咋回事？謝謝�。�！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】應(yīng)助回帖
rainontime(金幣+1): 不錯的 2011-08-01 18:10:16
1949stone(MolEPI+1): 不錯 不錯 2011-08-01 20:31:33
1949stone(MolEPI+1): 不錯 不錯 2011-08-01 20:31:33
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這是很正常的，一般酶切后的目的片段往往比pcr擴(kuò)增得到的跑膠拖后，主要有以下幾個物理因素造成： 1，因?yàn)檩d體屬于比較大的分子了，質(zhì)粒如果濃度較高的話，難免分子間的作用力較強(qiáng)，因?yàn)檫@種力的存在導(dǎo)致了目的片段跑膠速度較慢！ 2, 可能切得時間比較長，導(dǎo)致許多分子雜質(zhì)增多！ 3，如果很靠后的話極有可能你的凝膠濃度不均勻…… 暫時想到這么多！ |
2樓2011-08-01 17:23:48
rainontime
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3樓2011-08-01 18:08:50
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【答案】應(yīng)助回帖
1949stone(MolEPI+1): 來也 2011-08-01 20:32:03
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1：連接體系不知道你選擇的合適不，涂布了那么多板子怎么就長了一個單克隆，個人覺得你先從連接體系上著手，提高了連接的效率才能保證你做一次連接的成功率啊，你說是不？連接體系你先得定量看看你的載體和目的基因的量，如果量差不多的話，目的基因多加一些；當(dāng)然了你要確定你的載體和基因酶切完全了； 2：至于驗(yàn)證嘛，很簡單的，先把長出來的單克隆劃到相同抗性的板子上，然后做一個PCR初步驗(yàn)證看看，如果能夠P出來大小相同的一條帶那很有可能就對了，然后再提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證就OK了。 |
5樓2011-08-01 19:59:14
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