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rainontime新蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助 雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克隆的問(wèn)題
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本人將某 2600bp的目的基因 和 pet28a載體 雙酶切，切膠回收，T4連接酶4度過(guò)夜連接， 將10uL連接產(chǎn)物加到120uL感受態(tài)細(xì)胞中， 加入800uL無(wú)抗性培養(yǎng)基 搖菌50分鐘， 涂平板10塊，每塊80uL, 過(guò)夜后，發(fā)現(xiàn)只長(zhǎng)了一個(gè)菌落。。。挑取菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證是否是陽(yáng)性克隆，切成了兩條片段，發(fā)現(xiàn)其中較短的那條片段比目的片段長(zhǎng)�。。。。。。≌�(qǐng)問(wèn)這是咋回事？謝謝�。�！ |
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sunwei57
木蟲 (小有名氣)
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9樓2012-03-17 12:26:54
【答案】應(yīng)助回帖
rainontime(金幣+1): 不錯(cuò)的 2011-08-01 18:10:16
1949stone(MolEPI+1): 不錯(cuò) 不錯(cuò) 2011-08-01 20:31:33
1949stone(MolEPI+1): 不錯(cuò) 不錯(cuò) 2011-08-01 20:31:33
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這是很正常的，一般酶切后的目的片段往往比pcr擴(kuò)增得到的跑膠拖后，主要有以下幾個(gè)物理因素造成： 1，因?yàn)檩d體屬于比較大的分子了，質(zhì)粒如果濃度較高的話，難免分子間的作用力較強(qiáng)，因?yàn)檫@種力的存在導(dǎo)致了目的片段跑膠速度較慢！ 2, 可能切得時(shí)間比較長(zhǎng)，導(dǎo)致許多分子雜質(zhì)增多！ 3，如果很靠后的話極有可能你的凝膠濃度不均勻…… 暫時(shí)想到這么多！ |
2樓2011-08-01 17:23:48
rainontime
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3樓2011-08-01 18:08:50
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4樓2011-08-01 19:17:22
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