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sipin210新蟲 (初入文壇)
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[求助]
【求助/交流】酶切后的粘性末端補(bǔ)平
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最近在改造載體，想先將基礎(chǔ)載體酶切，得到粘性末端，然后用takara的dna blunting kit補(bǔ)平，再進(jìn)行平端的連接。做了一次，沒(méi)有篩到陽(yáng)性克隆。請(qǐng)問(wèn)大家有blunting的經(jīng)驗(yàn)嗎？ 還有，我可不可以將高保真酶和酶切回收產(chǎn)物72度共浴，從而利用高保真酶的3‘-5’外切酶活性把粘性末端切平呀？ |
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shaquila
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【答案】應(yīng)助回帖
sipin210(金幣+1): thx~很有用，很多想法我都會(huì)試試看能不能成功~ 2011-08-09 10:08:09
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lz是那端突出，你考慮用哪種酶不僅僅要考慮是否有活性，還要考慮活性的大小，不同酶的外切酶活性有的是針對(duì)粘端，有的是針對(duì)平端，有的甚至內(nèi)凹也能切～～～ lz關(guān)于自連可以看看這個(gè) http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=2941363 |
3樓2011-08-09 09:25:04
空谷幽風(fēng)
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2樓2011-08-08 12:15:44
shaquila
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4樓2011-08-09 13:43:32
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謝謝啦~上一次blunting失敗，我分步雙酶切質(zhì)粒之后做了膠回收，并補(bǔ)平，直接連我的平端的目的片段，長(zhǎng)了四十多個(gè)斑，鑒定都沒(méi)有連上我的目的片段55.。。 我這兩天打算再做一次補(bǔ)平，用試劑盒和高保真延伸都試一下。 我仔細(xì)看了一下，我用EcoRI和HindIII雙酶切載體，得到了兩個(gè)5‘的突出端，理論上高保真酶的5’3‘聚合酶活性就會(huì)補(bǔ)平粘性末端吧？ 然后我估計(jì)我的連接過(guò)程也存在問(wèn)題，我的目的片段是重疊pcr得到的，膠回收之后損失很大，這回我大批量回收哎... |
5樓2011-08-12 11:06:28
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