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friya0910新蟲 (正式寫手)
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[交流]
表達(dá)載體的構(gòu)建 已有6人參與
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本人已將目的片段載體亞克隆至克隆載體pMD19-T（Simple）載體中，現(xiàn)在要構(gòu)建表達(dá)載體，用限制性內(nèi)切酶將目的片段從克隆載體上切下，20微升的酶切體系中加10微升的質(zhì)粒。遇到一個問題就是雙酶切后克隆載體片段挺亮的，但目的片段非常的淡（目的片段較小，285bp），這樣會不會影響后面的連接反應(yīng)啊？我看網(wǎng)上說要保證連接的成功，目的片段和載體的濃度最好都大一些。如果做PCR然后酶切PCR產(chǎn)物的話，又存在擴(kuò)增過程中可能出現(xiàn)突變或者是無法判斷是否酶切完全。請各位高手指點(diǎn)一下��！ 圖片信息說明，Mark：200、500、800、1200、2000、3000、4500 第一張圖，除Mark外左數(shù)第一第二泳道分別為NcoI單酶切pET32a和BamHI單酶切pET32a，第三泳道為上述兩酶雙酶切pET32a，第四泳道為雙酶切帶有目的片段的pMD19-T（Simple）載體；均是20微升體系，質(zhì)粒10微升，酶各自1微升，切3h。 第二張圖，第一第二泳道NcoI和BamHI分別單酶切pET32a，第三泳道Mark，第四泳道雙酶切帶有目的片段的pMD19-T（Simple）載體（質(zhì)粒為公司測序后返還的質(zhì)粒），切4h，第五泳道為雙酶切帶有目的片段的pMD19-T（Simple）載體后切膠回收的目的片段，切了3管，每管20微升的體系，10微升的質(zhì)粒。 第三張圖，除Mark外左數(shù)第一和第二泳道為雙酶切雙酶切帶有目的片段的pMD19-T（Simple）載體，第三泳道為未酶切的帶有目的片段的pMD19-T（Simple）載體。切了4h。 大家?guī)臀铱纯�，pET32a載體3h和4h雙酶切切開了沒？目的片段的量做連接是不是太少了？有沒有什么好的建議啊！ [ Last edited by friya0910 on 2011-8-11 at 09:22 ] |
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 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
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friya0910
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
1949stone(MolEPI+1): 天使大哥 要epi好辦啊 2011-08-10 20:51:51
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
1949stone(MolEPI+1): 天使大哥 要epi好辦啊 2011-08-10 20:51:51
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1：樓主的目的片段285bp，確實(shí)太小了，20ul體系添加10ul重組載體，然后進(jìn)行酶切，當(dāng)然是可以酶切開的，但是你的目的片段由于太小了，所以導(dǎo)致出來的質(zhì)量太小而很淡，這樣做鏈接的話成功的概率確實(shí)很低；何不擴(kuò)大你的酶切體系至50ul或者更多，然后多添加一些酶，多切一會，然后跑個電泳，做一個切膠純化，然后再跑電泳定量一下，做一個連接，這樣成功概率會大很多； 2：當(dāng)然了，我還是建議你直接用原來基因的引物做一個PCR，然后純化，酶切，再純化，然后進(jìn)行連接，這樣也是很快的，而且成功率也比較高的！ 祝好運(yùn)！ |
4樓2011-08-10 20:50:11
friya0910
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5樓2011-08-10 21:13:54
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