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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 定量PCR求助！急！
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leon198418029金蟲 (小有名氣)
research associate
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[求助]
定量PCR求助！急！
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使用定量PCR可以進行SNP分析，原理為TAQMAN探針中若有一處堿基與模板鏈不互補，即不能結合進而水解產生熒光。 利用此原理，我設計了特異鑒定某種藻類的TAQMAN探針。由于另一種親緣關系極近的藻類的存在（我使用的是保守區(qū)域，ITS及其中間的5.8S rDNA區(qū)域，此處相似度達99%。另外18S，28S相似度也極高），設計此探針頗為費事。不過最終在此區(qū)域中找到一處堿基不同的地方，其兩側也適合設計定量PCR引物。本以為可以借鑒SNP的做法，達到特異鑒定目標藻的目的，但是，實驗中還是會對另一種藻產生擴增，只是Ct值出現(xiàn)較晚，在30以后。不過，這已經影響到我特異鑒定目標藻的目的。 現(xiàn)在不明白的是，既然SNP可以做到單堿基突變，探針即可不結合，為何在我這里不行？我也聽說過有同學在探針有一處堿基不匹配的情況下可以進行擴增的情況。那么到底探針在有一堿基不匹配的情況下，究竟是否能反應？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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2樓2011-08-14 19:55:19
leon198418029
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3樓2011-08-14 19:59:41
4樓2011-08-14 20:01:30
leon198418029
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5樓2011-08-14 20:04:36
6樓2011-08-14 20:26:45
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金幣+2): 鼓勵 2011-08-15 11:25:41
leon198418029(金幣+3): 雖然我不做SNP，但是你的講解很具體！多謝！ 2011-08-15 18:48:27
leon198418029(金幣+4): 長見識了！謝謝！ 2011-08-17 18:00:17
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 補上！學習了！ 2011-08-18 01:28:35
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leon198418029(金幣+4): 長見識了！謝謝！ 2011-08-17 18:00:17
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 補上！學習了！ 2011-08-18 01:28:35
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如果是SNP分型的話，你可以設計blocker，讓blocker與你的引物競爭性地與模板結合，可以減少錯配率。 blocker的序列跟引物只在序列變異的堿基處不同，即與野生株的模板序列是相同的，另外blocker在3‘端連有PO4基團，這樣可以對錯配起到阻滯作用。你可以查一下這方面的文獻。 |
7樓2011-08-15 09:34:50
【答案】應助回帖
| 我覺得一個堿基的話使用高保真酶是可以擴增的， 你可以試一試……順便問下樓主，我也在提藍藻的RNA，但方法都不是很好，請問你們使用什么方法提的？方便的話可聯(lián)系我：zhangauwind@mail.ahnu.edn.cn |
8樓2011-08-16 17:42:36
leon198418029
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9樓2011-08-17 18:00:51
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