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leon198418029金蟲 (小有名氣)
research associate
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[求助]
定量PCR求助！急！
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使用定量PCR可以進(jìn)行SNP分析，原理為TAQMAN探針中若有一處堿基與模板鏈不互補(bǔ)，即不能結(jié)合進(jìn)而水解產(chǎn)生熒光。 利用此原理，我設(shè)計(jì)了特異鑒定某種藻類的TAQMAN探針。由于另一種親緣關(guān)系極近的藻類的存在（我使用的是保守區(qū)域，ITS及其中間的5.8S rDNA區(qū)域，此處相似度達(dá)99%。另外18S，28S相似度也極高），設(shè)計(jì)此探針頗為費(fèi)事。不過最終在此區(qū)域中找到一處堿基不同的地方，其兩側(cè)也適合設(shè)計(jì)定量PCR引物。本以為可以借鑒SNP的做法，達(dá)到特異鑒定目標(biāo)藻的目的，但是，實(shí)驗(yàn)中還是會對另一種藻產(chǎn)生擴(kuò)增，只是Ct值出現(xiàn)較晚，在30以后。不過，這已經(jīng)影響到我特異鑒定目標(biāo)藻的目的。 現(xiàn)在不明白的是，既然SNP可以做到單堿基突變，探針即可不結(jié)合，為何在我這里不行？我也聽說過有同學(xué)在探針有一處堿基不匹配的情況下可以進(jìn)行擴(kuò)增的情況。那么到底探針在有一堿基不匹配的情況下，究竟是否能反應(yīng)？ |
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木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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1949stone(金幣+2): 鼓勵 2011-08-15 11:25:41
leon198418029(金幣+3): 雖然我不做SNP，但是你的講解很具體！多謝！ 2011-08-15 18:48:27
leon198418029(金幣+4): 長見識了！謝謝！ 2011-08-17 18:00:17
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 補(bǔ)上！學(xué)習(xí)了！ 2011-08-18 01:28:35
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leon198418029(金幣+4): 長見識了！謝謝！ 2011-08-17 18:00:17
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 補(bǔ)上！學(xué)習(xí)了！ 2011-08-18 01:28:35
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如果是SNP分型的話，你可以設(shè)計(jì)blocker，讓blocker與你的引物競爭性地與模板結(jié)合，可以減少錯配率。 blocker的序列跟引物只在序列變異的堿基處不同，即與野生株的模板序列是相同的，另外blocker在3‘端連有PO4基團(tuán)，這樣可以對錯配起到阻滯作用。你可以查一下這方面的文獻(xiàn)。 |
7樓2011-08-15 09:34:50
2樓2011-08-14 19:55:19
leon198418029
金蟲 (小有名氣)
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3樓2011-08-14 19:59:41
4樓2011-08-14 20:01:30
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