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[求助]
請(qǐng)教脂肪酶活性測(cè)定
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大家好，問個(gè)酶學(xué)的基本問題。 我利用分光光度計(jì)法pNPB測(cè)脂肪酶活性，測(cè)405nm處連續(xù)光吸收，根據(jù)初速度得到斜率，請(qǐng)問如何根據(jù)斜率來計(jì)算酶活結(jié)果，非常感謝！ |
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jinpeng_6118
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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利用分光光度計(jì)法pNPB測(cè)脂肪酶活性，酶比活計(jì)算公式如下： Beer定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為A=kbc， 摩爾吸光系數(shù)：公式A=kbc中的以為1mol/L,b為1cm時(shí)，則系數(shù)k稱為摩爾吸光系數(shù)，以ε表示，單位為升/（摩爾•厘米）[L/(mol•cm）]，A=kbc可寫成A=εc。 A:吸光值 c：pNP濃度 mol/L ε：摩爾吸光系數(shù) t：時(shí)間 min V：反應(yīng)體系體積 L △ M：pNP生成總量 單位mol 我們的b=1cm 因而公式：A=cε 所以我們測(cè)得的動(dòng)力學(xué)曲線斜率△A/t=ε△c/t=ε△M/tV △M/t=△A V /tε 。△M/t：每分鐘PNP的生成（mol/min），等同于每分鐘pNPB的分解量 1個(gè)酶活力單位定義為1分鐘水解底物生成1μmol對(duì)硝基苯酚(胺)所需要的酶量 所以酶比活計(jì)算公式：U/mg=10（6次方）x△A V /tεM=10（6次方）x K V/εM K為斜率，M為酶的加入量（單位mg），V為測(cè)定時(shí)的體積（L），ε：摩爾吸光系數(shù)0.016×106 L/(mol•cm) |
9樓2012-01-08 22:27:34
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【答案】應(yīng)助回帖
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lstt09nk(金幣+3): 鼓勵(lì)交流，歡迎常來 2011-08-23 13:27:36
lstt09nk(金幣+3): 鼓勵(lì)交流，歡迎常來 2011-08-23 13:27:36
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1分子的pNPB水解生成1分子的pNP（對(duì)硝基苯酚），pNP在405 nm下有特異性吸收，對(duì)應(yīng)有個(gè)摩爾消光系數(shù)ε（比如18.8 cm2/μmol，不同的文獻(xiàn)值會(huì)有略微差別，也可以你自己用pNP標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定。一般來說選一個(gè)值，然后注明參考文獻(xiàn)就行了），按下面這個(gè)式子計(jì)算酶活：U=（斜率×稀釋倍數(shù)）/（光程×摩爾消光系數(shù)） 其中： 斜率就是酶標(biāo)儀讀書，注意通常酶標(biāo)儀讀數(shù)單位是10^-3 min-1； 光程就是溶液最低處的厚度，需要量一下； 稀釋倍數(shù)是指體系體積與酶的加入量的比，比如200 ul體系+5 ul酶，稀釋倍數(shù)就是41. 最后注意檢查一下所有物理量的量綱要統(tǒng)一。 |
4樓2011-08-23 08:39:09
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【答案】應(yīng)助回帖
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看天(金幣+5, BioEPI+1): 鼓勵(lì)熱心回答 2011-08-26 12:53:19
看天(金幣+5, BioEPI+1): 鼓勵(lì)熱心回答 2011-08-26 12:53:19
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脂肪酶活性測(cè)定 1 pNP-乙腈-丙酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建： 原液：將pNP溶解與PBS（PH6.5,0.01M）和乙腈，丙酮溶液中。 稀釋液：及與配置原液時(shí)相同體積的PBS，乙腈，丙酮溶液。 10ml測(cè)試體系：原液投入量+稀釋液投入量 = 10ml 空白對(duì)照：稀釋液10ml 8組測(cè)試組：原液不同投入梯度+ 相應(yīng)稀釋液 = 10ml. 測(cè)OD405,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y = A x + B,和斜率 2 脂肪酶的酶活測(cè)定: Lipase 的游離酶的酶活測(cè)定: 第一步:稱取 Lipase 干粉(精酶),用10ml PH6.5 0.01m的PBS溶解保存. 第二步:移取上面配制的酶液50ul于搖瓶中,再加入PH 6.5 0.01m的PBS 2.8ml,在搖床中37度,150rpm 條件下震蕩幾分鐘后加入10mM 的對(duì)硝基苯酚乙酯150ul,加入后立即計(jì)時(shí)三分鐘反應(yīng).。 第三步:三分鐘反應(yīng)結(jié)束后立即加入丙酮3ml終止反應(yīng),繼續(xù)震蕩幾分鐘后過濾,取濾液靜態(tài)測(cè)OD405 值. 空白配制：PH 6.5 0.01m的PBS 2.85ml+對(duì)硝基苯酚乙酯+丙酮 3 比活力計(jì)算 將測(cè)得的0D405，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)活力測(cè)定反應(yīng)體積，脂肪酶蛋白濃度和反應(yīng)時(shí)間，得到比活力：X um/min/mg |
6樓2011-08-26 12:44:57
swqowen
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7樓2011-08-26 19:49:13
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8樓2011-08-26 19:49:48
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您好！ 我是做這方面實(shí)驗(yàn)的研究生，現(xiàn)在準(zhǔn)備些畢業(yè)論文，也遇到了這樣的問題。根據(jù)您的回答，我理解了這幾個(gè)公式，現(xiàn)在有個(gè)問題是這樣的，我做的反應(yīng)體系是100微升，是用酶標(biāo)儀測(cè)的OD405nm。因?yàn)楦鶕?jù)您最后的公式：U/mg=10（6次方）x△A V /tεM=10（6次方）x K V/εM，測(cè)得的脂肪酶活力只與A，V，t，和ε有關(guān)，與我底物的C物質(zhì)的量濃度沒有關(guān)系了。 我的問題是，我的底物濃度是0.5mmol/L不是1mol/L，反應(yīng)用的不是比色皿，b不是1cm，那我如何用摩爾消光系數(shù) 計(jì)算酶活力呢？謝謝！ |
10樓2014-06-24 21:41:45
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