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[求助]
求助：關(guān)于輔料在HPLC中雜質(zhì)峰很多，干擾多
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最近在做一個由各種注射用油混合而成的注射油溶液處方，做有關(guān)物質(zhì)時就是油溶液空白都會出很多個峰，有些跟主峰和有關(guān)物質(zhì)的峰很接近，如何是好�。坑袥]有哪位大俠有辦法除去油溶液基質(zhì)又可保留藥物的方法�。考彼廊肆�！ 大家在研發(fā)過程中出現(xiàn)輔料有嚴(yán)重干擾情況下除了換輔料意外，都用哪些方法處理的��？謝謝！ |
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常見色譜分析問題解疑 一、產(chǎn)生前沿和拖尾的原因一般有哪些？ （1）拖尾： 1.干擾峰，優(yōu)化條件分離 2 色譜柱塌陷，更換色譜柱 3 流動相pH不合適，調(diào)節(jié)pH值 4 管路沒有接好，存在較大的死體積，可以重新接一下 （2）前沿： 1 溶劑選擇不合適，選擇合適的溶劑 2 樣品過載，降低進(jìn)樣量 3 柱溫太低，升高柱溫 4 色譜柱損壞，更換色譜柱 5 干擾峰，優(yōu)化色譜條件分離 可能的問題：1.柱子問題2.流動相不恰當(dāng)3.定容樣品的溶劑不合適 產(chǎn)生峰前沿的原因：柱過載，柱頭塌陷，溶劑選擇不對 產(chǎn)生峰拖尾的原因：存在雜質(zhì)未分開，柱污染，柱子選擇不對。 拖尾峰與柱子有關(guān)，可能是過載，稀釋樣品再做，或換新柱做吧 一般產(chǎn)生托尾峰往往是有機(jī)性相近雜質(zhì)沒有分開，可以優(yōu)化分析方法，或更換柱子試一試；也可能由于柱子使用時間太久柱效下降出現(xiàn)塌陷等原因；再有也會根樣品本身性質(zhì)有關(guān)，基團(tuán)需要流動相中添加能與之結(jié)合優(yōu)化峰形的化學(xué)物質(zhì)，要根據(jù)具體情況而定。柱子可能污染了吧，溶劑也可能有，或柱效下降。 圖譜前沿和拖尾的原因主要是流動相選擇不合適，可以相應(yīng)調(diào)整流動相的極性，或者適當(dāng)加入酸來調(diào)整，可以得到較好的改善。一般來講，酸堿在流動相中對于前沿和拖尾影響較大。 柱前沿是可能因為柱超載，拖尾是可能因為樣品被污染，選擇合適的流動相，調(diào)節(jié)好PH能夠改善這以情況。 二、怎樣避免拖尾和前沿，有何措施？ 選擇合適的色譜條件和色譜柱，就可以避免峰拖尾和前沿 在處理樣品時選擇合適的流動相最為重要，所以在實驗設(shè)計時充分了解所要分離的物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和溶解度、極性等相關(guān)問題，摸條件時找到較好的流動相，是避免拖尾峰出現(xiàn)的最好方法。 避免拖尾和前沿主要要控制好溶質(zhì)的量，每種色譜方法有一定的線性范圍，超過這一范圍不對稱峰則會出現(xiàn)。 要看是由于什么原因造成的： 分析物本身的性質(zhì)：這類問題首先要選擇合適的色譜柱，另樣品的前處理非常重要，部分樣品在分析過程中分解，那肯定是拖尾的。 色譜柱問題：主要由于色譜柱柱效下降等引起，維護(hù)色譜柱或者更換 流動相：流動相未起到抑制拖尾或者前沿的作用，應(yīng)添加適當(dāng)緩沖劑如三乙胺、醋酸等。 三、一般拖尾比較厲害的是生物堿類成分的檢測，對此類物質(zhì)防止拖尾有什么好的建議嗎？ 對于生物堿類，應(yīng)該選用封端了的色譜柱，減少硅羥基的作用，還有就是調(diào)節(jié)流動相的PH值來避免拖尾 對于生物堿類成分的分離關(guān)鍵在于加入的酸的量，因為你得讓成分被色譜柱吸附后，能夠很好的溶解在流動相中，即解吸附下來才行啊，所以注意你的酸的加入量吧！還有就是選擇合適的色譜柱，最重要嘍！ 分離堿性物質(zhì)，易產(chǎn)生拖尾，一般我們都是在流動相中加點三乙胺（即堿性物質(zhì)）. 生物堿類液相色譜一般都會在流動相里加入少量堿（二乙胺或氨水等），使流動相的PH偏堿性。不過用普通的C18柱來分析可能進(jìn)不了幾針柱效就不行了，考慮使用寬PH范圍的C18柱。 關(guān)于生物堿薄層問題，可以對于薄層板的話可以用10%NaOH+CMC-Na溶液進(jìn)行鋪板，還可以適當(dāng)調(diào)節(jié)展開劑PH值來防治生物堿拖尾。 應(yīng)該加三乙胺吧，及三氟乙酸等調(diào)節(jié)PH值，使用氨基的色譜柱啊，不管怎么說首先考慮的是色譜柱的選擇。 四、 用HPLC進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？ 關(guān)于漂移問題： ① 溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定 ② 流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等 ③ 柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時間的平衡 關(guān)于快速變化問題 ① 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定 ② 泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。 ③ 流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合 五、液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？ ① 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。 ② 存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子 ③ 可能柱超載，減少進(jìn)樣量。 六、HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 ① 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量 ② 樣品未從柱子中流出�？筛鶕�(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子 ③ 樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器 ④ 檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。 ⑤ 檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù) ⑥ 檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。 ⑦ 檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。 ⑧ 記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。 ⑨ 流動相流量不合適。調(diào)整流速即可。 ⑩ 檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。 七、做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ ① 泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進(jìn)行脫氣處理； ② 比例閥失效，更換比例閥即可； ③ 泵密封墊損壞，更換密封墊即可； ④ 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法； ⑤ 系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可； ⑥ 梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。 八、最近更換了另一種牌號的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不能重現(xiàn)，為什么？ 這是因為被分析物可能具有形成氫鍵的能力。盡管過去幾年來，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號的ODS柱上的相對保留時間就可能不同。在流動相中加入少量競爭物，如三乙基胺（TEA），將會使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號柱子上的相對保留時間具有較好的重現(xiàn)性。 如分離情況可以，系統(tǒng)穩(wěn)定，達(dá)到系統(tǒng)適用性要求，就不必保留時間的重現(xiàn)。 九、購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么？ 柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。 ① 拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查； ② 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查； ③ 將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用于使用過的柱子。 ④ 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。 十、色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理 HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下，會出現(xiàn)各種意想不到的問題，而對色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對于新手更是如此。下面根據(jù)本人幾年工作的體會，提出一些看法，向同仁指教。 色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。 1、色譜柱 如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質(zhì)時，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報廢。 2、溶劑極性及進(jìn)樣量 許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰�。看味疾惶粯樱彝衔�，保留時間會提前(相對進(jìn)樣量少而言)，將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎�。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。 3、樣品的特性 有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。 4、參數(shù) 記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如C－R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變?yōu)槎䝼�峰或更多。 系統(tǒng)堵塞 問：我的系統(tǒng)壓力比它應(yīng)該的壓力高很多，是什么原因？ 答：首先，讓我們檢查一下你的前提，你怎么知道壓力應(yīng)該是多少？ 問：之前同樣的柱子，同樣的流動相，同樣溫度壓力只有2000PSI。現(xiàn)在是兩部了。我把泵壓的上限設(shè)為4000PSI，泵停了。 答：很好你有以前的參考數(shù)據(jù)，我們可以從這里開始排查故障。壓力變大，原因很多。首先，流動相的粘度可能不對。其次，系統(tǒng)某個地方可能堵了。后者比較常見，但是在我們拆系統(tǒng)前，先檢查下其他的可能。 你確定你的流動相是對的？如果用的是自動混合，你溶液有沒有放錯？例如把甲醇和乙腈弄混了（由于兩者與水混合液的粘度差異很容易導(dǎo)致壓力不同）。 如果使用了柱溫箱加熱，確認(rèn)一下它有沒有工作。溫度每變10℃粘度變化25%。所以如果你本來要開60℃，但是柱溫箱沒有工作，這樣壓力就會翻倍了。 問：OK，這個很容易檢查，其它還有哪些要檢查的？ 答：我經(jīng)常問這個問題，壓力變大是在長期分析中慢慢出現(xiàn)還是突然出現(xiàn)的。如果是突然出現(xiàn)的，可能是有些錯誤發(fā)生了。讓我們來檢查一些東西，從簡單的開始：柱子填料的顆粒大小對不對？柱子壓力與顆粒大小的平方成比例變化。如果你用5um的柱子代替10um的柱子，就可以解釋壓力的增加了。 不是這種情況，那么就有地方堵住了。首先卸掉柱子接二通，保護(hù)柱和柱前過濾器不要下下來。我們要檢查的一個可能是流動相不相容，如果接分析柱在后面的操作中可能對其有損。不連柱子，檢查壓力，如果還有1500多psi，那么是其他地方堵了，柱子是好的。我們可以在流路上一個一個斷開看哪里壓力最大。通常換一個部件比清洗更有效，但我們不是隨時都有備用的，所以可以考慮清洗。如果我們知道要除掉的是什么東西，那么就很容易知道怎么洗。假設(shè)是濾頭堵了，可能是上一次的流動相沒有排完，與新的流動相不相溶造成的�？赡苁蔷彌_鹽析出了。這種情況只要用能溶解析出鹽的溶液沖洗堵塞部位一段時間就可以了。 如果是分析柱或保護(hù)柱突然堵塞，就要檢查柱子的保存溶劑。保存溶劑可能與流動相不相溶而導(dǎo)致緩沖鹽析出。或者柱子用含鹽的流動相保存，而柱塞松動，導(dǎo)致流動相部分蒸發(fā)，有鹽析出。這時要用能溶解該鹽的流動相低流速沖洗柱子來恢復(fù)活性。 問：我的情況是在運行序列中間突然出現(xiàn)的，這是怎么回事呢？ 答：這種情況可能是系統(tǒng)的某部分被積累的小顆粒堵塞了。小顆粒可能來源于密封圈或樣品，可能是樣品不溶于流動相或者樣品強(qiáng)烈的吸附在保護(hù)柱或分析柱（沒用保護(hù)柱）上。這通常是樣品中大分子量的組分，而你沒有去除或者只是部分去除掉了，如血清樣品中的蛋白質(zhì)，制劑中的輔料或食品中的高分量組分。 如果你用了柱前過濾器和保護(hù)柱，讓我們依次下下來，測量系統(tǒng)壓力。這樣，我們應(yīng)該可以很快找到堵塞的部位。如果是保護(hù)柱和柱前過濾器堵了，最好更換掉。它們就是用來保護(hù)分析柱的。想要清洗它們接著使用是劃不來的，因為下次它們可能就不能擋住那些污染物了，而柱子就要弄壞了。 如果是分析柱堵了，最好是清理一下。但是最好的挽救是預(yù)防，考慮加個柱前過濾器，最好加個保護(hù)柱。如果問題來自樣品，就要把樣品過濾，或者用固相萃取除掉污染物。 如果有備用的柱子濾片，換掉柱頭進(jìn)口的濾片。沒有就把它拿下來，超聲清洗。這只對硅膠柱有用，如果是聚合柱（polymeric column），它的填料是有內(nèi)壓的，你一拿開濾片填料就會泄漏出來。這時如果手頭有備用的濾片，就要快速的更換并重新封好柱子，如果沒有就不要開聚合柱。 如果更換或清洗后壓力沒有降低，那么可能是有東西吸附在填料表面或者滲透到了柱子中間了。這時就要用能溶解或解吸收潛在污染物的溶液低流速沖洗柱子。柱子廠家都有介紹用一系列強(qiáng)度遞增的溶液來完成這個工作的。對反相柱來說，可以采取如下程序：水，甲醇，THF，二氯甲烷，甲醇再回到水。對正相柱程序的極性相反：二氯甲烷，THF，水，甲醇，二氯甲烷。如果還是沒用，可以考慮反向沖洗柱子。但是到了這個時候最好拿起電話去訂購一根新柱子。 柱子污染 問：我的柱子的壽命不是很長。進(jìn)了大概500針之后，峰就變寬了，還有拖尾。以前的柱子都能進(jìn)1000針左右，這根柱子哪里有問題？ 答：很有可能這根柱子啥問題都沒有。在我們詳細(xì)討論之前，我先問你一個問題，你用了保護(hù)柱沒有？ 問：沒有，但是我用了柱前過濾器。這也可以保護(hù)柱子，不是嗎？ 答：很不幸，柱前過濾器只能起到部分的保護(hù)作用。他們能夠除去流動相中的微粒。這些微粒來自于樣品或者液相系統(tǒng)的運動部位。柱前過濾器不能除去比過濾器小的顆粒，這些顆粒會吸附到填料表面。大部分情況下這些顆粒來自于樣品。你的樣品是什么？ 問：是固相萃取后的血漿。我承認(rèn)血漿的組分會使柱子壽命迅速降低，但是我的色譜圖很干凈，背景干擾很小。更重要的是，以前我們能夠進(jìn)1000針，只是現(xiàn)在的污染速度更快了。 答：在很多情況下，樣品的配制過程不是100%的完美。畢竟，還是有一些干擾出現(xiàn)在你的色譜圖中。同樣，盡管你很小心的配制，但是還是有一些蛋白質(zhì)殘留在樣品中。蛋白質(zhì)會強(qiáng)吸附在填料表面，慢慢聚集在柱頭。另外，背景污染物的濃度會因樣品而改變，因此在我看來，柱子壽命因一個或兩個原因而減少了是正常的。我的建議是使用保護(hù)柱來保護(hù)你的柱子。 問：我以前也用過保護(hù)柱，但是效果不是很好。峰形從一開始就很差。因此我認(rèn)為加保護(hù)柱不是一個好方法。 答：這要看你選的是什么類型的保護(hù)柱。我通常建議是用和分析柱一樣填料的保護(hù)柱。這樣相當(dāng)于把你的分析柱延長了，而污染物則被保護(hù)柱而不是分析柱所吸附。如果填料裝的好，對分離效果的影響是微乎其微的。有些情況可能還會更好一點。但這不是重點，重點是我們保護(hù)了分析柱。 如果選用與分析柱填料不一樣的保護(hù)柱，你就會看到峰形變差。另外，你也不知道保護(hù)柱的保護(hù)情況。這都是因為不同填料的保留能力不一樣導(dǎo)致的。所以，最好還是選用填料一致的分析柱和保護(hù)柱�？梢员ＷC你得到最好的保護(hù)和最小的峰形失真。 問：問題是保護(hù)柱很貴。說說柱子的再生和沖洗過程？ 答：我通常把柱子再生作為最后的選項，除非沒有其他選擇。再生問題是如果你知道污染物是什么，那么效果很好。在大部分情況下我們并不了解只能猜測柱子的污染物。另外，有時候污染物很難清除掉。你的問題就是這樣的例子。我推測污染物是一些細(xì)小的蛋白質(zhì)。建立一個很好的再生程序也是不容易的。廠家的說明書上有一些通用的清洗程序，但是不一定對你有幫助。在這些程序中，你要用一系列的溶劑沖洗柱子，這些溶劑可能會除去污染物。這樣花費相當(dāng)長的時間，并且不一定奏效。 所以，我還是傾向于使用保護(hù)柱。他們可以捕獲能夠富集在分析柱上的污染物。他們也不是那么的貴：只有分析柱的一小部分。只需幾分鐘就能更換分析柱，而要再生一根柱子要好幾個小時。時間的節(jié)約是明顯的，同時心情也好。如果你按照上面說的規(guī)則做，可以保證你工作的效率，避免很多頭疼的事情 色譜柱使用壽命 問：我的色譜柱進(jìn)樣大概100針后峰形變差了，踏板數(shù)很低，怎么回事？ 答：100針確實很少，一般情況下使用時間會長很多的。首先我們要確認(rèn)你的使用條件是不是導(dǎo)致色譜柱壽命下降的原因。 兩種基本情況： 1 在相同實驗中以前使用的色譜柱壽命長很多 2 在本實驗中用過的所有的色譜柱在使用相同次數(shù)后全部損壞 如果是第一種情況，應(yīng)該檢查一下實驗是否保持一致。樣品的組成改變了嗎？樣品中強(qiáng)吸收的污染物會破壞色譜柱的柱效。或者管路的密封圈是否完好？脫落的密封圈會堵塞色譜柱過濾器和填料的頂層，從而影響樣品的分布。 如果可以確認(rèn)色譜條件沒有變化，那么可以推測是柱床松動的原因。在實驗室和運輸過程中色譜柱劇烈的震動都會導(dǎo)致柱床松動。（色譜柱有沒有掉到地上？）或者也有可能使生產(chǎn)商的問題。而且這種問題標(biāo)準(zhǔn)色譜柱檢測中心是檢測不出來的，只有在用過一段時間后才會顯露出來。這種情況生產(chǎn)商會免費替換色譜柱。 問：那些生產(chǎn)商真好，但是我的情況不是這樣的。我的色譜柱總是用不了多長時間。有時候100針，有時候200針。200針還可以忍受，但是100針太差了。色譜柱開銷太大了，我該怎么辦？ 答：我完全同意你所說的。我們必須要找到原因然后看看我們能做些什么。 最大可能是樣品中的成分吸附在色譜柱的頂端�？赡苁窃诹鲃酉嘀胁蝗艿某恋砦锘蛘呤菑�(qiáng)吸收的物質(zhì)。隨著進(jìn)樣的增加這些污染物在色譜柱頂端累積，阻止樣品正常吸附和擴(kuò)散。從而導(dǎo)致峰形變差。通常這種問題和柱壓升高同時出現(xiàn)。 問：嗯，可能就是這個原因。我應(yīng)該怎么避免這種問題呢？ 答：有幾種方法可以采用。一，采用合適的樣品準(zhǔn)備技術(shù)處理樣品。用和分析柱相似的固相萃取柱進(jìn)行固相萃�。⊿PE：solid phase extraction）1效果很好。 另外一種非常有效的方法是使用保護(hù)柱。保護(hù)柱是作為犧牲柱裝在色譜柱前使用的，出現(xiàn)問題的時候就會被替換掉。為了獲得最好的分析效果，保護(hù)柱的填料和裝填技術(shù)必須和分析柱一樣。如果用不同品牌的填料就不能獲得最佳的分析性能和保護(hù)作用。不要用大些的顆粒型號，大的顆�；蜓b填不好的預(yù)柱會因譜帶擴(kuò)展而導(dǎo)致分離效果變差。 問：使用預(yù)柱聽起來不錯，還有其他方法嗎？ 答：還有其他一些方法，但是他們都有缺陷。 我不提倡用那些可能溶解色譜柱頂端污染物的溶劑去沖洗柱子。很多情況下，這個方法是沒有作用的。例如，如果沉積在色譜柱頂端的污染物是蛋白質(zhì)，你沖洗的時候他們已經(jīng)變性很久了，甚至可能交聯(lián)在一起，變得難以溶解。此外，通常色譜柱是處于水解平衡狀態(tài)，而每次沖洗都會除掉水解鍵合相。因此，重復(fù)的沖洗柱子會加速柱子的老化。而且，沖洗后還要用流動相平衡柱子，如果是做離子對色譜的話會消耗大量的時間。 另一個經(jīng)常用的方法是反沖柱子。如果用和流動相不同的溶劑沖洗會產(chǎn)生和上面相同的問題。如果用流動相的話，需要很長的時間才能除去污染物，也有可能根本就沒作用。同時，反沖柱子會削弱柱子。盡管現(xiàn)在的裝填技術(shù)可以使柱子承受反沖，但是一般情況下不要采取這種做法。 問：那么最好的建議就是使用預(yù)柱了？ 答：絕對是。預(yù)柱也沒那么貴-一般隨品牌和型號的不同價格在10$-50$之間，而他們所保護(hù)的柱子的價格是預(yù)柱的10倍左右啊。而且他們還可以避免其他來源的污染物的，這些污染物更加難以發(fā)現(xiàn)。這些來源包括比如流動相中的灰塵，泵脫落的密封圈的碎片，或者從流動相吸附的污染物等等。其中有些難以對付，而保護(hù)柱就可以阻擋這些。 問：還有其他縮短柱子使用壽命的原因嗎？ 答：有的，但是只要你按照生產(chǎn)商的說明使用柱子的話一般很少發(fā)生。 有一個可能就是流動相pH超出使用范圍而導(dǎo)致的柱子坍塌。樣品用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶解的話也會發(fā)生 另外，一些特別的柱子有特別注意的地方 例如氨基柱可以和醛，酮反應(yīng)。氨基柱在不含緩沖鹽的水溶液中會顯強(qiáng)堿性，分解部分硅膠。 暴露在錯誤溶劑中的柱子也會發(fā)生坍塌。因為這些柱子是基于非常松散的結(jié)構(gòu)。他們是因顆粒之間的黏著而部分的結(jié)合在一起的。如果置于能破化這種黏著的流動相中，柱床很有可能會坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在THF中有時就會發(fā)生這種問題。這也是不要沖洗柱子的另一個理由。 |
3樓2011-08-26 12:28:04
li_yeqing
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5樓2012-05-28 21:31:07
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