 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 3642 | 回復: 11 | |||
| 本帖產(chǎn)生 1 個 MolEPI ，點擊這里進行查看 | |||
在路上ing銀蟲 (小有名氣)
|
[求助]
求助：酚氯仿抽提的DNA，吸光曲線峰值總是在270nm附近
|
||
|
各位壇友，我用酚氯仿提的DNA，用NaNo DROP 1000 Spectrophotometer分光光度計檢測，其吸收曲線峰值總是在270nm附近，提示有明顯的苯酚污染！ 我用的酚是pH8.0左右的Tris飽和酚，抽吸的時候吸的是下層的苯酚，黃色的，未變質(zhì)。 我的操作習慣一般是用等體積酚抽一次，離心后取上清再用等體積氯仿異戊醇（24:1）抽提一次，然后用2倍體積無水乙醇或是1倍體積異丙醇沉淀，然后70%乙醇洗滌2-3次，結果總是如上所述，很糟糕。。。 先加1/2體積苯酚，然后不離心抽上清而是直接加1/2體積氯仿異戊醇（24:1）或者直接加入混好的25:24:1的商品化的酚氯仿異戊醇也試過了，結果基本同上。。。 加入有機溶劑后的混勻：之前我都是用轉速可調(diào)的漩渦振蕩器1300rpm混勻（之前看過一篇文獻，作者使用的是800rpm混勻，我在使用該轉速時，發(fā)現(xiàn)混勻效果并不理想--沒有出現(xiàn)有機相與水相混勻后呈現(xiàn)的乳狀渾濁液，我將轉速逐步上調(diào)后，發(fā)現(xiàn)1300rpm效果不錯）；后來還試過手搖顛倒混勻；最近由于擔心此驟與苯酚殘留有關，只是輕輕地翻轉EP管4-6次，每次翻轉都使兩相混勻成乳狀渾濁液了！結果我提出來的DNA的吸光曲線峰值仍然在270nm附近！ 最近兩次抽提我在加入有機溶劑后抽上清時特意只抽了2/3-3/4的上清，舍棄了相當一部分上清，結果仍然沒有改善！ 有網(wǎng)友曾說過對于苯酚殘留“多次 70% 乙醇洗滌也可以達到滿意的效果”，我也按照網(wǎng)友建議的手法洗滌的：離心--倒上清--再離心--抽出殘余上清，并且重復了該洗滌步驟2次。結果依舊。。。 提了很久了，一直是這樣，換試劑或者換人做也都試過，一直沒解決這個問題。。。 由于我是做一個方法比較，而酚氯仿純化是之前的研究者都一致采用的純化方法，我即使想給出我改進的其他純化方法也要先重復出前人的結果以供參照比較。在目前的這種情況下，苯酚殘留應該是明顯可見的，所以提取的純度肯定是不理想的。這種吸光曲線其核酸定量值肯定是不可信的。所以這個問題是不得不解決的！ 還請有經(jīng)驗的壇友給予指點，小生不勝感激！ PS：我用該方法提取的DNA經(jīng)分光光度計檢測，其260/280分布范圍很廣：1.38-2.07，一半以上分布在1.5-1.8； 260/230的分布范圍更寬：1-2.1都有。但是在吸收曲線峰值在270nm附近徘徊時，該比值有意義嘛？ 有網(wǎng)友還曾在帖子中寫道“甚至使用氯仿抽提一次就可以了”。這種方法我也嘗試過，效果不錯，大部分產(chǎn)物的吸光曲線峰值都是在260nm。只是有兩三個樣本的峰值在258或259nm處。只是心中仍有疑問：為什么大家公認的經(jīng)典的酚氯仿抽提純化到了我手上卻總是這種結果？難道真是RP問題？但是我自認為我RP不差啊，身邊的同學朋友也都這么認為>_< 附上我選取的幾張酚氯仿純化的DNA的吸光曲線照片。我的目的DNA含量不高（保存在20μl體系中，含量＜50ng/μl），所以曲線形狀不漂亮，各位壇友莫見笑>_< |
回復此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有256人回復
-
蛋白質(zhì)檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 小片段DNA電泳看不見條帶
已經(jīng)有9人回復
- 求助：如何由哌啶醋酸鹽制備哌啶？？？
已經(jīng)有5人回復
- 苯酚在高溫下（900-1400攝氏度）熱裂解（燃燒）的詳細化學反應機理
已經(jīng)有3人回復
- 【求助/交流】求助-苯酚氯仿純化DNA方法
已經(jīng)有12人回復
- 【求助/交流】酚、氯仿法提取細菌DNA的試劑配制問題
已經(jīng)有8人回復
- 【求助】農(nóng)藥劑型加工懸浮劑
已經(jīng)有3人回復
- 【求助】請教：石墨法做銅曲線，吸光度非常低問題？
已經(jīng)有9人回復
- 【求助/交流】怎么驗證我的RNA能不能用？
已經(jīng)有3人回復
- 【求助】求教關于納米材料生長機理
已經(jīng)有4人回復
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 不給EPI就對不住了！確實，加氯仿后不劇烈震蕩是混不好的！ 2011-11-17 19:04:52
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 不給EPI就對不住了！確實，加氯仿后不劇烈震蕩是混不好的！ 2011-11-17 19:04:52
|
再仔細看了一下你的操作，加入有機溶劑（氯仿）抽提時“輕輕地翻轉EP管4-6次，每次翻轉都使兩相混勻成乳狀渾濁液了” 不可能吧？ 哪有那么容易輕輕翻轉一下就兩相混勻的了？ 如果你要求的基因組并不是極高的完整性，建議拇指支持住EP管底，食指緊握EP管蓋，猛烈的或盡你所能最快速的上下劇烈晃動30-60s. 我試過提出來的DNA并不會斷裂很明顯，>23k是沒問題的。但如果你真的要求提到的基因組>100kb的勿試....很多人都是怕會搞斷DNA，其實DNA并沒有想像中那么脆弱。 |
9樓2011-11-17 10:53:19
西瓜
榮譽版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 應助: 94 (初中生)
- 貴賓: 3.157
- 金幣: 1849.6
- 散金: 11458
- 紅花: 116
- 沙發(fā): 21
- 帖子: 7553
- 在線: 1449.5小時
- 蟲號: 271749
- 注冊: 2006-08-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 細胞衰老
- 管轄: 分子生物
2樓2011-10-07 18:07:43
大孫20111987
新蟲 (小有名氣)
- 應助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 643.3
- 紅花: 1
- 帖子: 143
- 在線: 32.3小時
- 蟲號: 1413382
- 注冊: 2011-09-22
- 性別: MM
- 專業(yè): 微生物遺傳育種學
3樓2011-10-07 21:33:01
4樓2011-11-10 11:49:48
75372017
木蟲 (初入文壇)
- 應助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 2704
- 帖子: 21
- 在線: 18.7小時
- 蟲號: 617647
- 注冊: 2008-10-05
- 性別: GG
- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學
5樓2011-11-10 14:28:13
zy4315456
新蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1678.1
- 帖子: 125
- 在線: 174.4小時
- 蟲號: 1428687
- 注冊: 2011-10-06
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學
在路上ing6樓2011-11-11 11:11:03
在路上ing
銀蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 316.9
- 帖子: 97
- 在線: 28.3小時
- 蟲號: 1125080
- 注冊: 2010-10-17
- 性別: GG
- 專業(yè): 法醫(yī)物證學、法醫(yī)人類學
7樓2011-11-16 22:29:54
8樓2011-11-17 10:41:13
10樓2011-11-17 19:55:33
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 在路上ing 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0703化學調(diào)劑 +3 | pupcoco 2026-03-17 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 簡單點0 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考博] 環(huán)境領域全國重點實驗室招收博士1-2名 +3 | QGZDSYS 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +3 | 睿08 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085601專碩，總分342求調(diào)劑，地區(qū)不限 +4 | share_joy 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料與化工求調(diào)劑 +6 | 為學666 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +4 | △小透明* 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料工程專碩調(diào)劑 +5 | 204818@lcx 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 考研化學學碩調(diào)劑，一志愿985 +4 | 張vvvv 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 26考研求調(diào)劑 +6 | 丶宏Sir 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 梁成偉老師課題組歡迎你的加入 +8 | 一鴨鴨喲 2026-03-14 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +3 | 聽風就是雨； 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 機械專碩325，尋找調(diào)劑院校 +3 | y9999 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +4 | ahbd 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[考研]
 機械專碩調(diào)劑
+3
|
笨笨兔子 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 309分請求調(diào)劑 +7 | dtdxzxx 2026-03-12 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料301分求調(diào)劑 +5 | Liyouyumairs 2026-03-12 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0856化學工程280分求調(diào)劑 +4 | shenzxsn 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +3 | 李政瑩 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學碩求調(diào)劑 +3 | 崔wj 2026-03-12 | 4/200 |
|