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在路上ing銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助：酚氯仿抽提的DNA，吸光曲線峰值總是在270nm附近
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各位壇友，我用酚氯仿提的DNA，用NaNo DROP 1000 Spectrophotometer分光光度計檢測，其吸收曲線峰值總是在270nm附近，提示有明顯的苯酚污染！ 我用的酚是pH8.0左右的Tris飽和酚，抽吸的時候吸的是下層的苯酚，黃色的，未變質(zhì)。 我的操作習(xí)慣一般是用等體積酚抽一次，離心后取上清再用等體積氯仿異戊醇（24:1）抽提一次，然后用2倍體積無水乙醇或是1倍體積異丙醇沉淀，然后70%乙醇洗滌2-3次，結(jié)果總是如上所述，很糟糕。。。 先加1/2體積苯酚，然后不離心抽上清而是直接加1/2體積氯仿異戊醇（24:1）或者直接加入混好的25:24:1的商品化的酚氯仿異戊醇也試過了，結(jié)果基本同上。。。 加入有機(jī)溶劑后的混勻：之前我都是用轉(zhuǎn)速可調(diào)的漩渦振蕩器1300rpm混勻（之前看過一篇文獻(xiàn)，作者使用的是800rpm混勻，我在使用該轉(zhuǎn)速時，發(fā)現(xiàn)混勻效果并不理想--沒有出現(xiàn)有機(jī)相與水相混勻后呈現(xiàn)的乳狀渾濁液，我將轉(zhuǎn)速逐步上調(diào)后，發(fā)現(xiàn)1300rpm效果不錯）；后來還試過手搖顛倒混勻；最近由于擔(dān)心此驟與苯酚殘留有關(guān)，只是輕輕地翻轉(zhuǎn)EP管4-6次，每次翻轉(zhuǎn)都使兩相混勻成乳狀渾濁液了！結(jié)果我提出來的DNA的吸光曲線峰值仍然在270nm附近！ 最近兩次抽提我在加入有機(jī)溶劑后抽上清時特意只抽了2/3-3/4的上清，舍棄了相當(dāng)一部分上清，結(jié)果仍然沒有改善！ 有網(wǎng)友曾說過對于苯酚殘留“多次 70% 乙醇洗滌也可以達(dá)到滿意的效果”，我也按照網(wǎng)友建議的手法洗滌的：離心--倒上清--再離心--抽出殘余上清，并且重復(fù)了該洗滌步驟2次。結(jié)果依舊。。。 提了很久了，一直是這樣，換試劑或者換人做也都試過，一直沒解決這個問題。。。 由于我是做一個方法比較，而酚氯仿純化是之前的研究者都一致采用的純化方法，我即使想給出我改進(jìn)的其他純化方法也要先重復(fù)出前人的結(jié)果以供參照比較。在目前的這種情況下，苯酚殘留應(yīng)該是明顯可見的，所以提取的純度肯定是不理想的。這種吸光曲線其核酸定量值肯定是不可信的。所以這個問題是不得不解決的！ 還請有經(jīng)驗的壇友給予指點，小生不勝感激！ PS：我用該方法提取的DNA經(jīng)分光光度計檢測，其260/280分布范圍很廣：1.38-2.07，一半以上分布在1.5-1.8； 260/230的分布范圍更寬：1-2.1都有。但是在吸收曲線峰值在270nm附近徘徊時，該比值有意義嘛？ 有網(wǎng)友還曾在帖子中寫道“甚至使用氯仿抽提一次就可以了”。這種方法我也嘗試過，效果不錯，大部分產(chǎn)物的吸光曲線峰值都是在260nm。只是有兩三個樣本的峰值在258或259nm處。只是心中仍有疑問：為什么大家公認(rèn)的經(jīng)典的酚氯仿抽提純化到了我手上卻總是這種結(jié)果？難道真是RP問題？但是我自認(rèn)為我RP不差啊，身邊的同學(xué)朋友也都這么認(rèn)為>_< 附上我選取的幾張酚氯仿純化的DNA的吸光曲線照片。我的目的DNA含量不高（保存在20μl體系中，含量＜50ng/μl），所以曲線形狀不漂亮，各位壇友莫見笑>_< |
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 不給EPI就對不住了！確實，加氯仿后不劇烈震蕩是混不好的！ 2011-11-17 19:04:52
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 不給EPI就對不住了！確實，加氯仿后不劇烈震蕩是混不好的！ 2011-11-17 19:04:52
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再仔細(xì)看了一下你的操作，加入有機(jī)溶劑（氯仿）抽提時“輕輕地翻轉(zhuǎn)EP管4-6次，每次翻轉(zhuǎn)都使兩相混勻成乳狀渾濁液了” 不可能吧？ 哪有那么容易輕輕翻轉(zhuǎn)一下就兩相混勻的了？ 如果你要求的基因組并不是極高的完整性，建議拇指支持住EP管底，食指緊握EP管蓋，猛烈的或盡你所能最快速的上下劇烈晃動30-60s. 我試過提出來的DNA并不會斷裂很明顯，>23k是沒問題的。但如果你真的要求提到的基因組>100kb的勿試....很多人都是怕會搞斷DNA，其實DNA并沒有想像中那么脆弱。 |
9樓2011-11-17 10:53:19
西瓜
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在路上ing6樓2011-11-11 11:11:03
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7樓2011-11-16 22:29:54
★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+4): Good! 2011-11-17 19:03:24
西瓜(金幣+4): Good! 2011-11-17 19:03:24
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NanoDrop 1000個人認(rèn)為其讀數(shù)在0-30甚至40間的讀數(shù)太小，不可信，所以其比值也不可信，更不要說260/230,260/280了。 試過用Trizol提RNA當(dāng)樣品所提的濃度很低時，其也是像樓主所說的這種情況。大多數(shù)認(rèn)為270有吸光是有酚污染。不過我覺得如果可以先把樣品的濃度提上去，使其所測濃度>50ng/ul，再來看操作上的問題。所以從某種程序上說也可以理解成樣品問題。 另外，酚后一般會使用氯仿再抽一次，混勻要充分，時間可久一點。 |
8樓2011-11-17 10:41:13
10樓2011-11-17 19:55:33
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