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illcf_11銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌基因重組時PKD46高溫怎么都消除不了
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小妹這些時間在做red基因重組技術(shù)，遇到pkd46質(zhì)粒在高溫下（42度甚至45度）還無法消除。具體步驟如下： 1、將PKD46化轉(zhuǎn)到W3110中，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，初步驗證后，接種至AMP培養(yǎng)基中30度過夜培養(yǎng)，次日1：1000轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.2時加入，阿拉伯糖至終濃度100mM,繼續(xù)培養(yǎng)到OD0.6時，制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞。 2、將打靶分子（pkd3來源，氯霉素抗性）200ng左右，1800V,4.1至4.3ms電轉(zhuǎn)至感受態(tài)中，37度培養(yǎng)2h后，涂布于氯霉素抗性的LB平板，37度過夜培養(yǎng)。 3、將氯霉素平板上長出的克隆，再次在氯霉素板上劃線，并PCR驗證基因組是否敲除。陽性結(jié)果再制備化轉(zhuǎn)感受態(tài)，準備將pcp20轉(zhuǎn)進去，將氯霉素抗性消除�？墒谴稳� 平板上的克隆數(shù)巨多。 推測是在制備感受態(tài)的時候之前的pkd46沒有消除。于是將具有氯霉素抗性的單克隆接種至搖瓶，提高培養(yǎng)溫度至42甚至45度，企圖消除內(nèi)涵的pkd46，轉(zhuǎn)接數(shù)次，劃線amp平板，均生長狀態(tài)良好。如今我無法消除pkd46，嚴重影響后面轉(zhuǎn)化pcp20后，陽性克隆的挑選率。 哪位高手能指教一下……到底哪里出錯，或是可以怎么解決 |
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