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belinda227

木蟲 (小有名氣)

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專業(yè): 食品科學(xué)

[求助] 再次求助畢赤酵母無法分泌表達(dá)

belinda227 wrote:
我的蛋白是個同源四聚體，每個亞基的分子量為57KD，是胞內(nèi)酶，AT含量很高，達(dá)到60%。選取亞基的片段與pPICZαA構(gòu)建了重組表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化SMD-1168宿主菌。前期經(jīng)過抗生素梯度抗性篩選，并經(jīng)PCR驗證正確。根據(jù)操作手冊，用甲醇誘導(dǎo)其表達(dá)，在上清液中一直無法測到酶活。請各位畢赤酵母表達(dá)高手指點(diǎn)迷津，謝謝了！
如上所述，是我前期在論壇上求助了帖子。該蛋白基因克隆自一種酵母，在大腸桿菌中實現(xiàn)了活力胞內(nèi)表達(dá)，證實其為同源四聚體。經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)N-端27個氨基酸可能是個線粒體前導(dǎo)肽（引導(dǎo)蛋白進(jìn)入線粒體后會被切除）。是否有可能是該預(yù)測的前導(dǎo)肽的存在影響了在畢赤酵母SMD-1168中的分泌表達(dá)？或者還是有其他原因（如基因中存在信號肽切割位點(diǎn)，或者多亞基如何聚合等等）？現(xiàn)在正猶豫是否需要切除該前導(dǎo)肽序列，重新做一遍。但由于時間緊迫，故想先和大家探討該種原因的可能性。非常感謝！

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1樓 2011-10-27 17:25:30

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