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XUMIN6891金蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR一直擴(kuò)不出目的條帶
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| 各位大蝦你們好：我想問一下我最近跑pcr一直擴(kuò)不出我的目的條帶，我退后溫度從49度到60度都跑過還是沒結(jié)果，我的引物合成單上的這對引物其中一條引物的Tm值是52.74，一條Tm值是55.02，我跑pcr的程序是95度2min，94度40s，55度40s，72度40s，循環(huán)35個，72度10min，4度保存。我的體系是模板2ul，dntp1ul，引物各1ul，buffer5ul，Taq酶1ul,DDW39ul，共50ul的體系。我的模板是提取的重組質(zhì)粒！各位高手給小妹指點(diǎn)一下吧！謝謝了！ |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | PCR技術(shù) | 分子生物 |
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blackrose8089
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7樓2011-10-29 20:19:32
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8樓2011-10-30 09:13:01
【答案】應(yīng)助回帖
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首先說個體外話：建議你換一個程序哦 你的變性、退火、延伸時間都太長了（300bp的片段延伸就算是高保真酶也只要10s就夠了），你的程序太浪費(fèi)時間了。 1、在做其他的嘗試前，建議你先確認(rèn)你的體系中各成分是否有被污染、有沒有失效。 2、如果模板濃度非常高，降低點(diǎn)濃度試試； 3、兩條引物的退火溫度差異不大，不需要做TouchDown；但是建議你檢查一下你的引物匹配程度，有無可能錯配；要是都沒問題，向引物合成公司投訴，要求重合。（有的時候出現(xiàn)雙帶甚至多帶并不是因?yàn)槟愕囊镌O(shè)計(jì)有問題，而是合成公司做純化、或者分裝時壓根就把引物給污染）。 |
9樓2011-10-30 18:24:52
10樓2011-10-30 18:29:23
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