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XUMIN6891金蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR一直擴(kuò)不出目的條帶
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| 各位大蝦你們好：我想問一下我最近跑pcr一直擴(kuò)不出我的目的條帶，我退后溫度從49度到60度都跑過還是沒結(jié)果，我的引物合成單上的這對引物其中一條引物的Tm值是52.74，一條Tm值是55.02，我跑pcr的程序是95度2min，94度40s，55度40s，72度40s，循環(huán)35個(gè)，72度10min，4度保存。我的體系是模板2ul，dntp1ul，引物各1ul，buffer5ul，Taq酶1ul,DDW39ul，共50ul的體系。我的模板是提取的重組質(zhì)粒！各位高手給小妹指點(diǎn)一下吧！謝謝了！ |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | PCR技術(shù) | 分子生物 |
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imyting
至尊木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
| 個(gè)人感覺不是體系的原因，我曾經(jīng)遇到過N次這種情況，一次是因?yàn)閮啥艘餄舛炔灰粯釉斐傻模ǹ匆锖铣蓡紊系腛D值），一次是因?yàn)橐镌O(shè)計(jì)上有問題。樓主這個(gè)很明顯退火溫度已經(jīng)不能再降了，已經(jīng)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增了；另外，你的buffer中加過MgCL2了嗎？還有就是你的兩端引物是不是太短了��？加上保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)，Tm值才五十多？最后一個(gè)不明白的地方是，你的Taq酶加的好多�。ú贿^應(yīng)該不會影響效果）！ |
7樓2011-10-29 20:19:32
blackrose8089
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2樓2011-10-28 22:29:33
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3樓2011-10-29 15:33:16
4樓2011-10-29 17:56:13
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