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[求助]
酶的純化問(wèn)題
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| 在下，目前正在純化一個(gè)酸性酶，用離子交換層析去純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化出來(lái)的結(jié)果，跑電泳出現(xiàn)了6-7條帶，并且靠得很近，這樣下一步，很難處理，老師想讓我用純化后的蛋白質(zhì)再去讓同一根離子柱，該怎么辦？？各位大俠幫忙一下！��！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
mengfei8336(MolEPI+1): 2011-11-09 20:11:17
BIO-che(金幣+1): 98分 是個(gè)高手 可以看出來(lái) 很喜歡你 2011-11-13 00:09:21
BIO-che(金幣+1): 98分 是個(gè)高手 可以看出來(lái) 很喜歡你 2011-11-13 00:09:21
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剛看了樓主的站內(nèi)短信，特回復(fù)如下： 1、關(guān)于淀粉酶有多少個(gè)亞基的問(wèn)題，就目前文獻(xiàn)報(bào)道，我印象中沒(méi)有看到為多亞基四級(jí)結(jié)構(gòu)的alpha-淀粉酶和糖化酶，其它淀粉酶是否為僅有三級(jí)結(jié)構(gòu)我就不知道了。 2、樓主用陰離子交換層析，pH5.0的緩沖系統(tǒng)，陰離子交換層析要求使用的pH系統(tǒng)起碼比目的蛋白質(zhì)高1個(gè)pH值單位，也就是說(shuō)此時(shí)淀粉酶的等電點(diǎn)小于或者等于4。就未知的淀粉酶來(lái)說(shuō)，在不純的情況下等電點(diǎn)確定起來(lái)存在誤差，而小于4的淀粉酶比較少見，我懷疑可能目的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)高于4.0，pH5.0的體系不一定合適，如果真的如此，則會(huì)造成洗脫行為不穩(wěn)定。加上醋酸-醋酸鈉緩沖液不是很穩(wěn)定的緩沖體系，緩沖區(qū)間很窄。如果可以，建議使用6.0，換用其它緩沖體系。 3、關(guān)于分子篩，G75的分離范圍適用于不超過(guò)100KD的蛋白質(zhì)，要求目的蛋白質(zhì)與雜質(zhì)蛋白質(zhì)分子量為2倍關(guān)系，或者相差更大。加上分子篩也不是能將兩個(gè)蛋白質(zhì)完全分開的，一個(gè)蛋白質(zhì)的持續(xù)出峰時(shí)間會(huì)較長(zhǎng)，造成相互污染。由于你的蛋白質(zhì)雜帶較多，所以我對(duì)分離效果不持樂(lè)觀態(tài)度。 4、除了改變體系的pH值之外，還有更好的可能值得嘗試，用疏水層析柱。換一種分離原理可能會(huì)提高分離效果。假如你們沒(méi)有純化儀，那就買空柱和填料自己裝一根，不會(huì)很貴的。買的時(shí)候注意買使用范圍廣的苯基Phenyl。僅用強(qiáng)陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾就能使蛋白質(zhì)純化，我認(rèn)為需要很大的運(yùn)氣。 5、純化之后要跑SDS-PAGE才能判斷，下次要上圖。 |
7樓2011-11-09 20:04:22
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