 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 5668 | 回復(fù): 13 | ||||||||
| 本帖產(chǎn)生 2 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | ||||||||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | ||||||||
木左左銀蟲 (正式寫手)
|
[求助]
高GC含量基因片段PCR問(wèn)題
|
|||||||
|
大家好，我現(xiàn)在克隆一組目的片段，以cDNA為模板，片段大小2kbp左右，GC含量均超過(guò)60%，實(shí)驗(yàn)做了2個(gè)多月，沒(méi)有進(jìn)展，很是苦惱 主要用的大連寶生物的la酶和GCbuffer 我在網(wǎng)上搜過(guò)，高GC含量片段國(guó)內(nèi)肯定很多學(xué)校有成熟的方法，國(guó)外更多的是專利，我希望大家能幫幫我，他別是一下問(wèn)題： 1.關(guān)于引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題，需要特別注意什么？ 2.反應(yīng)體系的問(wèn)題，個(gè)組分的量，哪種酶效果好，額外的試劑？ 3.程序問(wèn)題，Tm值較高，是不是退火溫度也可以比較高？變形溫度用不用很高？ 4.比較高的GC含量到底對(duì)基因的結(jié)構(gòu)有什么影響？ 如果哪位師兄師姐有這方面的經(jīng)驗(yàn)或者是專利方面的信息業(yè)希望可以告訴我，小弟不勝感激，謝謝大家！ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 PCR技術(shù) | 生物信息學(xué)軟件應(yīng)用 | 【分子生物】EPI帖 | 有助于于我的SNP |
| 生物資源 | 基因工程和分子生物學(xué) |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有269人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
天津商業(yè)大學(xué) 生物與醫(yī)藥課題組招生
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 大片段PCR擴(kuò)增求助
已經(jīng)有34人回復(fù)
- 關(guān)于GC含量高的模板
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 基因組中長(zhǎng)片段PCR應(yīng)該注意的幾個(gè)問(wèn)題
已經(jīng)有14人回復(fù)
- PCR ， 雙酶切，連接問(wèn)題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- pcr，RACE,低表達(dá)量基因的克隆
已經(jīng)有8人回復(fù)
- PCR 擴(kuò)全長(zhǎng)
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 【求助/交流】菌落PCR求助
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 【求助/交流】基因組PCR老P不出目的帶
已經(jīng)有39人回復(fù)
木左左
銀蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 436.7
- 散金: 70
- 帖子: 324
- 在線: 103.4小時(shí)
- 蟲號(hào): 1020700
- 注冊(cè): 2010-05-17
- 專業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
3樓2011-12-09 17:04:27
brightfuture01
木蟲之王 (文壇精英)
我愛(ài)打老虎
- MolEPI: 14
- 應(yīng)助: 24 (小學(xué)生)
- 貴賓: 1.2
- 金幣: 113310
- 散金: 1526
- 紅花: 224
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 28948
- 在線: 3691.8小時(shí)
- 蟲號(hào): 464575
- 注冊(cè): 2007-11-21
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
1949stone(MolEPI+1): 很好 2011-12-09 00:57:55
木左左(金幣+5): 非常感謝 2011-12-09 17:01:21
木左左(金幣+5): 非常感謝 2011-12-09 17:01:21
|
1，如果是為了表達(dá)的話，引物設(shè)計(jì)時(shí)候可以將一部分GC變成其他堿基（在編碼的氨基酸不變的情況下）,，這樣可以使得引物的退火溫度降低。 2，我當(dāng)初做GC的時(shí)候就是用的TaKaRa的酶和buffer，效果還不錯(cuò)，70%+的GC，有兩種GC buffer A 和B，如果A不行的話試試B。 3，Tm高的話，退火溫度可以適當(dāng)設(shè)置高一些。變性也可以比95度高那么幾度。 4， 這個(gè)問(wèn)題我回答不了。 我的一點(diǎn)建議： 如果PCR產(chǎn)物很弱的話，可以做個(gè)膠回收，連T，然后讓其在質(zhì)粒里面復(fù)制從而獲得大量的目的基因片段。 PCR不一定非要使用公司的GCbuffer，可以試著加點(diǎn)DMSO、NaOH、甘油等東西試試。60%應(yīng)該不是很難擴(kuò)增的。 |
2樓2011-12-08 23:32:53
luckyhongli
金蟲 (小有名氣)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
- 金幣: 1164.9
- 散金: 132
- 紅花: 6
- 帖子: 292
- 在線: 62.4小時(shí)
- 蟲號(hào): 1530774
- 注冊(cè): 2011-12-09
- 性別: GG
- 專業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
mengfei8336(MolEPI+1): 2011-12-09 19:15:40
木左左(金幣+5): 非常感謝，不知道您能不能告知聯(lián)系方式，我好繼續(xù)向您請(qǐng)教 2011-12-09 21:40:41
木左左(金幣+5): 非常感謝，不知道您能不能告知聯(lián)系方式，我好繼續(xù)向您請(qǐng)教 2011-12-09 21:40:41
|
這個(gè)問(wèn)題我在國(guó)外的時(shí)候也碰到過(guò)，當(dāng)時(shí)我擴(kuò)增一個(gè)基因的promoter區(qū)，GC含量70%以上，后來(lái)解決了： 方法1. 巢式PCR，在目的片段的兩端非高GC含量區(qū)設(shè)計(jì)引物，比如可以擴(kuò)增2500到3000 bp，然后以此為模板進(jìn)行第二次PCR。 方法2. 換酶，我用過(guò)ABI的gold 360，附帶GC buffer，效果非常不錯(cuò)。提醒一下，GC buffer的用量要摸索。 你的問(wèn)題答復(fù)如下： 我在網(wǎng)上搜過(guò)，高GC含量片段國(guó)內(nèi)肯定很多學(xué)校有成熟的方法，國(guó)外更多的是專利，我希望大家能幫幫我，他別是一下問(wèn)題： 1.關(guān)于引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題，需要特別注意什么？ > 我用Primer3Plus設(shè)計(jì)引物，效果非常好。引物設(shè)計(jì)的注意事項(xiàng)較多，在這里關(guān)鍵不要在3‘末端有連續(xù)的G或C。 2.反應(yīng)體系的問(wèn)題，個(gè)組分的量，哪種酶效果好，額外的試劑？ > ABI的金牌360，額外的GC buffer。 3.程序問(wèn)題，Tm值較高，是不是退火溫度也可以比較高？變形溫度用不用很高？ > 退火溫度最高在63或65度，再高也沒(méi)有好處。 根據(jù)酶的不同，變性溫度可以在95度5到10分鐘。 4.比較高的GC含量到底對(duì)基因的結(jié)構(gòu)有什么影響？ > 一般啟動(dòng)子區(qū)域或遺傳印記區(qū)域GC含量較高， 本人博士畢業(yè)后在國(guó)外做博士后幾年，目前在上海一著名大學(xué)任教授，具有多年的分子生物學(xué)經(jīng)驗(yàn) |
4樓2011-12-09 17:45:42
brightfuture01
木蟲之王 (文壇精英)
我愛(ài)打老虎
- MolEPI: 14
- 應(yīng)助: 24 (小學(xué)生)
- 貴賓: 1.2
- 金幣: 113310
- 散金: 1526
- 紅花: 224
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 28948
- 在線: 3691.8小時(shí)
- 蟲號(hào): 464575
- 注冊(cè): 2007-11-21
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)
5樓2011-12-09 18:13:25
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 化工調(diào)劑303分，過(guò)四級(jí) +8 | 棲梧待風(fēng) 2026-04-02 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 求調(diào)劑22408 288分 +3 | new382 2026-04-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿復(fù)旦材料，英一專碩，總分357調(diào)劑 +3 | 1050389037 2026-04-02 | 4/200 |
|
|
[考研] 0832食品科學(xué)與工程學(xué)碩282調(diào)劑 +4 | 魚在水中游a 2026-04-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 298求B區(qū)調(diào)劑 +4 | zzz，，r 2026-04-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 找調(diào)劑 +6 | 楚喬喬 2026-04-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +5 | 熹僖XX 2026-03-31 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +8 | 薛定諤的虎。 2026-04-01 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 0856，269分求調(diào)劑 +8 | 有學(xué)上就行求求?/a> 2026-03-30 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 307分求調(diào)劑 +14 | (o~o) 2026-03-31 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 085600 一志愿9 總分351 求調(diào)劑學(xué)校 +7 | czhcz 2026-03-31 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 材料與化工調(diào)劑一志愿大連海事085600，349 +9 | 吃的不少 2026-03-30 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +7 | BrightLL 2026-03-29 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 276求調(diào)劑 +3 | 趙久華 2026-03-29 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +3 | 哇呼哼呼哼 2026-03-29 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料與化工專碩378求調(diào)劑 +3 | 塔比烏斯 2026-03-30 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 297 地理學(xué)070500 復(fù)試求調(diào)劑 +3 | 小圓圈圈ooo 2026-03-30 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 343求調(diào)劑 +6 | 愛(ài)羈絆 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 數(shù)一英一271專碩（085401）求調(diào)劑，可跨 +7 | 前行必有光 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 394求調(diào)劑 +3 | 好事多磨靜候佳?/a> 2026-03-26 | 5/250 |
|