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flytime1115銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
有木有人做過Taqman 探針法Real-Time？？ 已有1人參與
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| 我要檢測基因組中插入的某個外源片段的拷貝數，需要做絕對定量。師兄建議不要用sybr 燃料做，建議用探針法做�，F在毫無頭緒，不知道怎么設計，怎么合成？望各位高人指點一下…… |
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sandisk411
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數 +1
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good！ 2011-12-24 15:28:26
感謝參與，應助指數 +1
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good！ 2011-12-24 15:28:26
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TaqMAN法和SYB法都可以用于檢測拷貝數，關鍵是你能不能設計出合適的探針。用RT-PCR法鑒定拷貝數需要你對材料非常了解，比如是轉基因T0代，如果是單拷貝的，插入目的基因與參考基因（基因組里單拷貝）的比值應是1:2；雙拷貝的，就該是1:1；如果T1代，RT-PCR用于單株分析時，情況會很復雜，可以說你將無法準確判斷，除非你已知是純合的單株。 對于遺傳背景不清楚的，你最好用SOURTHERN雜交確認，這是最可靠和簡單的方法了。 要不，你可以嘗試，把插入片段的左、右兩邊的序列給克隆測序。 |
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flytime111516樓2011-12-24 12:11:26
2樓2011-12-22 16:45:28
shaquila
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flytime1115
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flytime1115
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5樓2011-12-22 19:38:04
shaquila
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6樓2011-12-22 23:55:56
austin2008
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7樓2011-12-23 09:01:32
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| 我做過檢測重組畢赤酵母中外源基因拷貝數的實驗，用的就是探針法，內參用的是GAPDH，檢測的準確度和重復性還是很好的！引物和探針你自己不要設計，交給專業(yè)的設計公司設計和合成，也不是很貴，國內的公司一套探針引物（包括上下游引物，探針）也就1200+吧，國外的ABI等公司合成一般要貴一倍左右，一般可以做1500-2000個樣品。SYBY法不是很準確，精確定量最好還是用探針法，我的實驗用的樣品的基因組DNA和你的不大一樣，不過原理差不多的。 |
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9樓2011-12-23 09:16:52
shaquila
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wanhscn(金幣+2): good 2011-12-24 17:10:10
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還好吧，轉基因能插入多少多少拷貝呢，至少在植物轉化中，幾乎所有文獻都是用southern雜交檢測，有嘗試過用熒光定量，但是效果顯然不如此法準確，至少存在爭議 下面是探討用熒光定量驗證植物轉基因拷貝數的文獻 Two-fold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by real-time PCR Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR |
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10樓2011-12-23 10:00:20
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