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flytime1115銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
有木有人做過(guò)Taqman 探針?lè)≧eal-Time？？ 已有1人參與
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| 我要檢測(cè)基因組中插入的某個(gè)外源片段的拷貝數(shù)，需要做絕對(duì)定量。師兄建議不要用sybr 燃料做，建議用探針?lè)ㄗ觥，F(xiàn)在毫無(wú)頭緒，不知道怎么設(shè)計(jì)，怎么合成？望各位高人指點(diǎn)一下…… |
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sandisk411
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good！ 2011-12-24 15:28:26
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good！ 2011-12-24 15:28:26
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TaqMAN法和SYB法都可以用于檢測(cè)拷貝數(shù)，關(guān)鍵是你能不能設(shè)計(jì)出合適的探針。用RT-PCR法鑒定拷貝數(shù)需要你對(duì)材料非常了解，比如是轉(zhuǎn)基因T0代，如果是單拷貝的，插入目的基因與參考基因（基因組里單拷貝）的比值應(yīng)是1:2；雙拷貝的，就該是1:1；如果T1代，RT-PCR用于單株分析時(shí)，情況會(huì)很復(fù)雜，可以說(shuō)你將無(wú)法準(zhǔn)確判斷，除非你已知是純合的單株。 對(duì)于遺傳背景不清楚的，你最好用SOURTHERN雜交確認(rèn)，這是最可靠和簡(jiǎn)單的方法了。 要不，你可以嘗試，把插入片段的左、右兩邊的序列給克隆測(cè)序。 |
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flytime111516樓2011-12-24 12:11:26
2樓2011-12-22 16:45:28
shaquila
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3樓2011-12-22 18:04:14
flytime1115
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4樓2011-12-22 19:37:05
flytime1115
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5樓2011-12-22 19:38:04
shaquila
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6樓2011-12-22 23:55:56
austin2008
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8樓2011-12-23 09:03:35
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【答案】應(yīng)助回帖
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wanhscn(金幣+2): 感謝參與交流 2011-12-24 17:09:48
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| 我做過(guò)檢測(cè)重組畢赤酵母中外源基因拷貝數(shù)的實(shí)驗(yàn)，用的就是探針?lè)�，�?nèi)參用的是GAPDH，檢測(cè)的準(zhǔn)確度和重復(fù)性還是很好的！引物和探針你自己不要設(shè)計(jì)，交給專(zhuān)業(yè)的設(shè)計(jì)公司設(shè)計(jì)和合成，也不是很貴，國(guó)內(nèi)的公司一套探針引物（包括上下游引物，探針）也就1200+吧，國(guó)外的ABI等公司合成一般要貴一倍左右，一般可以做1500-2000個(gè)樣品。SYBY法不是很準(zhǔn)確，精確定量最好還是用探針?lè)�，我的�?shí)驗(yàn)用的樣品的基因組DNA和你的不大一樣，不過(guò)原理差不多的。 |
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9樓2011-12-23 09:16:52
shaquila
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還好吧，轉(zhuǎn)基因能插入多少多少拷貝呢，至少在植物轉(zhuǎn)化中，幾乎所有文獻(xiàn)都是用southern雜交檢測(cè)，有嘗試過(guò)用熒光定量，但是效果顯然不如此法準(zhǔn)確，至少存在爭(zhēng)議 下面是探討用熒光定量驗(yàn)證植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的文獻(xiàn) Two-fold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by real-time PCR Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR |
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10樓2011-12-23 10:00:20
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