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[交流] 載體構(gòu)建技術(shù)請(qǐng)教，如何設(shè)計(jì)引物提取基因插入載體中？

現(xiàn)在的目的是：
1、從人的細(xì)胞中獲取MUC1基因的序列，這一步需要說(shuō)一下引物設(shè)計(jì)方面信息，有個(gè)問(wèn)題，除了設(shè)計(jì)出引物P出基因的CDS序列之外，肯定是需要在這個(gè)CDS序列前后加入酶切位點(diǎn)的，但是本身基因沒(méi)有酶切位點(diǎn)，這個(gè)怎么才能加上酶切位點(diǎn)？
2、vector的酶切酶連，酶切就是容易，但是選擇的酶切類型應(yīng)該要與之前P出的基因加上去兩端的酶切位點(diǎn)一致的，是吧？
3、如果是做shRNA和microRNA研究，序列怎么添加酶切位點(diǎn)？
最好舉個(gè)例。
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1樓 2011-12-28 15:38:49

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hyacinth326

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小丹木木(金幣+3): 鼓勵(lì)新蟲(chóng)發(fā)帖哦，GOOD! 2012-01-09 09:44:13

看來(lái)這個(gè)問(wèn)題沒(méi)人回答，我就答一下吧，樓主應(yīng)該是不常做分子這一塊的實(shí)驗(yàn)吧。這個(gè)問(wèn)題的解決思路是：
1、分析你想要做的基因的序列的限制性酶切圖譜和你要用到的載體的多克隆位點(diǎn)，選取兩個(gè)你基因上沒(méi)有酶切位點(diǎn)但是載體的多克隆位點(diǎn)上有的酶切位點(diǎn)，而且這兩個(gè)酶最好是常用的，可以雙酶切的。
2、設(shè)計(jì)引物，將酶切位點(diǎn)加在你設(shè)計(jì)的上下游引物上，此時(shí)你要確定載體上多克隆位點(diǎn)的表達(dá)是有方向的，哪個(gè)酶切位點(diǎn)在前面你就把哪個(gè)酶切位點(diǎn)放在上游引物上，后面的放在下游引物上。你也可以在引物的酶切位點(diǎn)上加上保護(hù)堿基。
3、用引物pcr擴(kuò)增目的基因，將其連在克隆載體上，如果引物上有保護(hù)堿基的話也可以直接將PCR產(chǎn)物酶切，與酶切之后的載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌就可以了。

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2樓2012-01-08 21:56:49

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hshzhq

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引用回帖:

2樓: Originally posted by hyacinth326 at 2012-01-08 21:56:49:
看來(lái)這個(gè)問(wèn)題沒(méi)人回答，我就答一下吧，樓主應(yīng)該是不常做分子這一塊的實(shí)驗(yàn)吧。這個(gè)問(wèn)題的解決思路是：
1、分析你想要做的基因的序列的限制性酶切圖譜和你要用到的載體的多克隆位點(diǎn)，選取兩個(gè)你基因上沒(méi)有酶切位點(diǎn) ...

雙酶切是什么意思？需要考慮兩個(gè)不同切割酶的Buffer性質(zhì)和其他特性嗎？“如果引物上有保護(hù)堿基的話也可以直接將PCR產(chǎn)物酶切，與酶切之后的載體連接”里面的意思是不是退火成雙鏈后就可以酶切，是這個(gè)意思嗎？

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3樓2012-01-09 23:11:29

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hyacinth326

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西瓜(金幣+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-01-10 17:34:11
hshzhq(金幣+5): 2012-01-18 15:53:59

引用回帖:

對(duì)啊，需要考慮要用到的兩種酶的性質(zhì)啊，看看是否有通用的buffer，PCR產(chǎn)物最好是凝膠回收或者是PCR產(chǎn)物回收之后，再酶切。

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4樓2012-01-10 11:48:16

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