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651424759新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
overlap PCR做不出來(lái)吶。。。。
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| 連接兩個(gè)片段，分別PCR均P出來(lái)，連接做不出來(lái)，試過(guò)好幾次了。片段分別為1500和3000，變性時(shí)間2min，延伸5min。求助各位前輩。。。不甚感激�。�！ |
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651424759(金幣+10): ★★★★★最佳答案 各方面的情況都分析到啦，O(∩_∩)O謝謝 2012-01-12 09:44:00
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 根據(jù)樓主反饋，授予EPI！ 2012-01-17 21:18:54
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4樓2012-01-09 15:11:00
imyting
至尊木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木(金幣+2): 很專業(yè)哦，值得學(xué)習(xí) 2012-01-09 13:36:08
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小丹木木(金幣+2): 很專業(yè)哦，值得學(xué)習(xí) 2012-01-09 13:36:08
| OVERLAPPING PCR一般來(lái)說(shuō)應(yīng)該分為三步，第一步正是樓主說(shuō)的分別P兩個(gè)片段，第二步應(yīng)該是不加兩端引物以兩個(gè)片段的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行3-5個(gè)循環(huán)（此步驟退火溫度可以低點(diǎn)），第三步是在第二步反應(yīng)終止時(shí)加入兩端引物條件自定。關(guān)鍵還是退火溫度的控制，有時(shí)候你P不出來(lái)不一定就是你的條件不好。我也試過(guò)不經(jīng)過(guò)第二步直接P，也有成功的時(shí)候。如果實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)比較充裕還是買試劑盒吧，大約50元一次。你也可以把你的PCR條件附上，大家都看看怎么樣。 |
2樓2012-01-09 12:44:15
fwks3518
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3樓2012-01-09 14:12:26
651424759
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5樓2012-01-09 15:20:28
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