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651424759

新蟲 (初入文壇)

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[求助] overlap PCR做不出來吶。。。。

連接兩個片段，分別PCR均P出來，連接做不出來，試過好幾次了。片段分別為1500和3000，變性時間2min，延伸5min。求助各位前輩。。。不甚感激�。�！

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1樓 2012-01-09 10:09:42

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匿名

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★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜(金幣+2): 鼓勵交流 2012-01-09 17:50:25
651424759(金幣+10): ★★★★★最佳答案各方面的情況都分析到啦，O(∩_∩)O謝謝 2012-01-12 09:44:00
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 根據(jù)樓主反饋，授予EPI！ 2012-01-17 21:18:54

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4樓2012-01-09 15:11:00

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imyting

至尊木蟲 (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+2): 很專業(yè)哦，值得學習 2012-01-09 13:36:08

OVERLAPPING PCR一般來說應(yīng)該分為三步，第一步正是樓主說的分別P兩個片段，第二步應(yīng)該是不加兩端引物以兩個片段的PCR產(chǎn)物為模板進行3-5個循環(huán)（此步驟退火溫度可以低點），第三步是在第二步反應(yīng)終止時加入兩端引物條件自定。關(guān)鍵還是退火溫度的控制，有時候你P不出來不一定就是你的條件不好。我也試過不經(jīng)過第二步直接P，也有成功的時候。如果實驗室經(jīng)費比較充裕還是買試劑盒吧，大約50元一次。你也可以把你的PCR條件附上，大家都看看怎么樣。

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悠哉游哉做實驗，成兮敗兮我隨便

2樓2012-01-09 12:44:15

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fwks3518

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜(金幣+3): 鼓勵交流！不過融合后的量一般很少，也可以不純化直接作為模板大量擴增的。 2012-01-09 17:50:14

1、擴增A: 1.5k和B：3k的兩個片段，純化后備用
2、以純化后的A、B片段為模板，以A的5‘端引物和B的3’端引物來進行重疊PCR
3、PCR產(chǎn)物膠回收，切4.5K片段純化。
4、以該片段為模板，大量擴增

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3樓2012-01-09 14:12:26

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wk990240

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如果條件充許，可以分鐘克隆兩個片段，比如A和B，并且在A的3端和B的5端加上共有的酶切位點，直接兩個片段回收后，同時連進表達載體。我經(jīng)常這樣操作，沒有大問題的。祝樓主成功。

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15樓2012-05-28 14:36:34

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mxlo.o

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引用回帖:

4樓: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-09 15:11:00
1、分別擴增兩個片段，純化后備用
2、以純化后的兩個片段為模板，以前面片段的5‘端引物和后面片段的3’端引物來進行重疊PCR。正常情況下就可以擴增出條帶專一的目的條帶了。如果目的條帶很弱可以進行步驟3.
3、P ...

我的融合PCR兩個月前偶然出來一次，自從產(chǎn)物用完之后再沒有出來過。逐漸摸索條件認為是模板的原因�，F(xiàn)在通過轉(zhuǎn)化挑單克隆獲得了非常單一的PCR模板。但是還是擴增不出來。我的兩個片段均為1.5kb左右，我配的12.5ul的體系，模板各加100ug，使用兩步PCR，PCR后跑膠，總是在1.5kb出現(xiàn)比較亮的帶，然后自點樣孔到1.5kb處很彌散。不知你遇到過這樣的情況沒，怎么解決

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17樓2012-08-13 21:42:09

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651424759

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引用回帖:

樓: Originally posted by imyting at 2012-01-09 12:44:15:
OVERLAPPING PCR一般來說應(yīng)該分為三步，第一步正是樓主說的分別P兩個片段，第二步應(yīng)該是不加兩端引物以兩個片段的PCR產(chǎn)物為模板進行3-5個循環(huán)（此步驟退火溫度可以低點），第三步是在第二步反應(yīng)終止時加入兩端引物 ...

非常感謝！實驗室的師姐說沒必要進行第二步，我就省略了。兩個引物的退火溫度分別為61.99和63.80，我試過退火溫度為60,58，都沒有P出來呢。

體系是：Buffer       5                   條件是：初始變性  94    6min
         dNTP（10mM）1.5                         變性    94       2min
         primerA    1                               退火    58/60    1min10s
         primerB    1                               延伸    72       5min
         TemplateA 1                               32cycle
         templateB 1                               最終延伸 72    15min
         Enzyme       1

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5樓2012-01-09 15:20:28

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樓: Originally posted by fwks3518 at 2012-01-09 14:12:26:
1、擴增A: 1.5k和B：3k的兩個片段，純化后備用
2、以純化后的A、B片段為模板，以A的5‘端引物和B的3’端引物來進行重疊PCR
3、PCR產(chǎn)物膠回收，切4.5K片段純化。
4、以該片段為模板，大量擴增

嗯嗯，就是第2步做不出來呢。。。

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6樓2012-01-09 15:21:26

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樓: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-09 15:11:00:
1、分別擴增兩個片段，純化后備用
2、以純化后的兩個片段為模板，以前面片段的5‘端引物和后面片段的3’端引物來進行重疊PCR。正常情況下就可以擴增出條帶專一的目的條帶了。如果目的條帶很弱可以進行步驟3.
3、 ...

非常感謝！我的重疊部位是27bp，退火溫度可以降低到什么程度呢？

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7樓2012-01-09 15:27:10

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imyting

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【答案】應(yīng)助回帖

★
西瓜(金幣+1): 鼓勵交流 2012-01-09 17:50:44

重疊27已經(jīng)不少了啊，做個退火溫度的梯度吧，同一條件可以多試幾次。不一定就是條件的原因

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悠哉游哉做實驗，成兮敗兮我隨便

8樓2012-01-09 16:28:47

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skyseaapple

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wanhscn(金幣+2): 鼓勵新蟲友發(fā)帖！ 2012-01-10 13:47:50

樓主可以多加你的片段A與片段B，然后再試個梯度，應(yīng)該沒什么問題的

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9樓2012-01-10 09:52:42

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clfhnb

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★
西瓜(金幣+1): 鼓勵新蟲交流！ 2012-01-17 21:19:29

第一次的PCR產(chǎn)物純化最好用切膠的方式純化。。。
重疊延伸的時候注意兩個PCR產(chǎn)物的比例，一般是1:1..
用一步法的重疊延伸比較好。。。

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10樓2012-01-17 15:35:56

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