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651424759新蟲 (初入文壇)
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[求助]
overlap PCR做不出來吶。。。。
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| 連接兩個片段，分別PCR均P出來，連接做不出來，試過好幾次了。片段分別為1500和3000，變性時間2min，延伸5min。求助各位前輩。。。不甚感激�。�！ |
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 【分子生物】EPI帖 | 蛋白質(zhì)表達(dá) | 實(shí)驗(yàn)技巧以及英語學(xué)習(xí)相關(guān) |
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skyseaapple
鐵蟲 (小有名氣)
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9樓2012-01-10 09:52:42
imyting
至尊木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+2): 很專業(yè)哦，值得學(xué)習(xí) 2012-01-09 13:36:08
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+2): 很專業(yè)哦，值得學(xué)習(xí) 2012-01-09 13:36:08
| OVERLAPPING PCR一般來說應(yīng)該分為三步，第一步正是樓主說的分別P兩個片段，第二步應(yīng)該是不加兩端引物以兩個片段的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行3-5個循環(huán)（此步驟退火溫度可以低點(diǎn)），第三步是在第二步反應(yīng)終止時加入兩端引物條件自定。關(guān)鍵還是退火溫度的控制，有時候你P不出來不一定就是你的條件不好。我也試過不經(jīng)過第二步直接P，也有成功的時候。如果實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)比較充裕還是買試劑盒吧，大約50元一次。你也可以把你的PCR條件附上，大家都看看怎么樣。 |
2樓2012-01-09 12:44:15
fwks3518
木蟲 (正式寫手)
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3樓2012-01-09 14:12:26
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜(金幣+2): 鼓勵交流 2012-01-09 17:50:25
651424759(金幣+10): ★★★★★最佳答案 各方面的情況都分析到啦，O(∩_∩)O謝謝 2012-01-12 09:44:00
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4樓2012-01-09 15:11:00
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