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倔強(qiáng)的投手新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
Western若干問(wèn)題
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我剛開(kāi)始做Western，很多東西還不是很了解，目前內(nèi)參還沒(méi)有做出來(lái)。有一些問(wèn)題想請(qǐng)教大家： 1 我的目的蛋白在40kD左右，12%的膠，電泳條件是：濃縮膠60V，分離膠100V。轉(zhuǎn)膜的時(shí)候是恒壓60V，膠上的Marker基本都轉(zhuǎn)過(guò)去了。不知道這樣的條件是否合適，有人說(shuō)300mA轉(zhuǎn)30-40分鐘就差不多了。我的膠是0.75mm的，最佳的轉(zhuǎn)膜條件應(yīng)該是多少��？ 2 我的上樣量大概25微克左右，剛開(kāi)始做的時(shí)候，是不是應(yīng)該多點(diǎn)點(diǎn)樣��？ 3 一抗孵育的時(shí)候，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室沒(méi)有反轉(zhuǎn)的一起，所有我就直接平放在4度冰箱里的，這樣會(huì)有影響嗎？ 4 我現(xiàn)在做的目的蛋白，市面上沒(méi)有針對(duì)我所做的物種的特異性抗體，這樣是不是就要訂做抗體？訂做抗體是不是需要該蛋白的編碼序列，只有部分序列可以嘛？訂做一個(gè)抗體大概要多少錢(qián)�。� |
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倔強(qiáng)的投手
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2樓2012-02-23 12:30:27
sjn0301
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【答案】應(yīng)助回帖
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倔強(qiáng)的投手(金幣+2): ★★★很有幫助 2012-03-13 09:28:11
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倔強(qiáng)的投手(金幣+2): ★★★很有幫助 2012-03-13 09:28:11
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1.因?yàn)闆](méi)有看到你的結(jié)果，所以不確定是否需要改變條件，我們實(shí)驗(yàn)室做western也用0.75mm的膠，轉(zhuǎn)膜條件是100V 1h，電流大概在每個(gè)槽子200-240mA，這和轉(zhuǎn)膜buffer的濃度有關(guān)。 2.上樣量根據(jù)你的結(jié)果而定吧，信號(hào)強(qiáng)弱和一抗，二抗?jié)舛纫灿嘘P(guān)系 3.最好不要這樣，個(gè)人平放的孵育效果和搖床差很多。當(dāng)然如果你一抗足夠好用可能也能得出不錯(cuò)的結(jié)果。 4.很多抗體都是根據(jù)目標(biāo)蛋白某一段序列設(shè)計(jì)的，當(dāng)然為了提高抗體特異性，當(dāng)然能提供的越完整越好。 |
3樓2012-03-04 20:16:29
sjn0301
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zyw_821212
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 我們實(shí)驗(yàn)室是專門(mén)做western的，你是做什么蛋白的，我們這里有很多內(nèi)參蛋白。 其次，轉(zhuǎn)膜分濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)，不知道你的是什么轉(zhuǎn)膜儀，才能知道需要轉(zhuǎn)多少時(shí)間。孵育時(shí)在搖床上就行，如果沒(méi)有平放也是沒(méi)問(wèn)題的。 |
5樓2012-03-12 19:28:23
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