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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » Western若干問題
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Western若干問題
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我剛開始做Western，很多東西還不是很了解，目前內(nèi)參還沒有做出來。有一些問題想請教大家： 1 我的目的蛋白在40kD左右，12%的膠，電泳條件是：濃縮膠60V，分離膠100V。轉膜的時候是恒壓60V，膠上的Marker基本都轉過去了。不知道這樣的條件是否合適，有人說300mA轉30-40分鐘就差不多了。我的膠是0.75mm的，最佳的轉膜條件應該是多少啊？ 2 我的上樣量大概25微克左右，剛開始做的時候，是不是應該多點點樣啊？ 3 一抗孵育的時候，因為實驗室沒有反轉的一起，所有我就直接平放在4度冰箱里的，這樣會有影響嗎？ 4 我現(xiàn)在做的目的蛋白，市面上沒有針對我所做的物種的特異性抗體，這樣是不是就要訂做抗體？訂做抗體是不是需要該蛋白的編碼序列，只有部分序列可以嘛？訂做一個抗體大概要多少錢��？ |
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sjn0301
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4樓2012-03-04 20:17:32
2樓2012-02-23 12:30:27
sjn0301
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【答案】應助回帖
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倔強的投手(金幣+2): ★★★很有幫助 2012-03-13 09:28:11
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1.因為沒有看到你的結果，所以不確定是否需要改變條件，我們實驗室做western也用0.75mm的膠，轉膜條件是100V 1h，電流大概在每個槽子200-240mA，這和轉膜buffer的濃度有關。 2.上樣量根據(jù)你的結果而定吧，信號強弱和一抗，二抗?jié)舛纫灿嘘P系 3.最好不要這樣，個人平放的孵育效果和搖床差很多。當然如果你一抗足夠好用可能也能得出不錯的結果。 4.很多抗體都是根據(jù)目標蛋白某一段序列設計的，當然為了提高抗體特異性，當然能提供的越完整越好。 |
3樓2012-03-04 20:16:29
zyw_821212
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5樓2012-03-12 19:28:23
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