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liumangtu403鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
請(qǐng)教有關(guān)提取人肝臟組織RNA提取的技術(shù) 已有3人參與
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各位高手，本菜鳥提取肝組織RNA大半個(gè)月仍未能成功，跪求各位高手幫助，感激涕零！ 我將組織放在研缽中液氮研磨， 將組織研磨到粉末后加1ml trizol到研缽中，繼續(xù)研磨成粉末后放入超凈臺(tái)中等待融化，之后將液體吸入EP管進(jìn)行RNA提取。說(shuō)明書上提到1ml TRIZOL可以溶解50——100mg組織，但我加入50mg組織后產(chǎn)生大量沉淀，且液體呈現(xiàn)黑色，似乎無(wú)法溶完這么多組織，且后續(xù)電泳表明RNA降解，而加入較少的組織(10mg左右)提取的RNA又很少，估計(jì)只有幾微克，濃度太低無(wú)法使用。想請(qǐng)問(wèn)各位高手，肝組織是RNA含量較高的組織，為何我研磨的很細(xì)了還是提不出足夠量的RNA？1mlTRIZOL應(yīng)溶解多少mg組織合適？ 另外列上后面的RNA提取步驟，請(qǐng)各位高手指正： 1、TRIZOL移入EP管后，吹打混勻（我們實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有勻漿機(jī)，只能將粉末研磨到足夠細(xì)） 2、12000rmp離心10分鐘離去不溶物（省略該部是否會(huì)影響RNA得率？） 3、室溫放置10min, 加入氯仿200ul/每管，劇烈震蕩15s,冰上放置5min(有網(wǎng)友提到要放置15min,但我放置15min后離心上層呈現(xiàn)淡黃色，蛋白層變薄，不知有沒(méi)有問(wèn)題) 4、取上清（上清的液體量多是否表明RNA得量多？） 5、500ul 異丙醇沉淀，冰置10min,12000rmp離心10min. 6、1ml 75%乙醇洗一遍，12000rmp 離心5min 7、超凈臺(tái)晾干5min,加入Rnase-free 水 急盼各位高手回復(fù) ，謝謝！ |
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2樓2012-08-14 18:25:00
可憐我的生活
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
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- 帖子: 104
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- 注冊(cè): 2014-01-26
- 專業(yè): 生物化學(xué)
3樓2018-10-21 20:18:55
實(shí)驗(yàn)加油
禁言 (初入文壇)
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4樓2018-12-10 10:52:23
【答案】應(yīng)助回帖
| 用Trizol能提RNA的，個(gè)人比覺(jué)得還要需要從提量下手，我們實(shí)驗(yàn)室用BIODAI離心提取法單次處理的樣本量可以達(dá)到1000μL，樓主需要注意用Trizol每個(gè)步驟操作要快，用的時(shí)間藥短些，防止RNA降解,異丙醇沉淀的時(shí)候，放-20°C的冰箱半個(gè)小時(shí)，或再適當(dāng)延長(zhǎng)一點(diǎn)時(shí)間。迅速離心，之后加75%乙醇。只洗一遍，洗2遍易損失部分RNA。不要過(guò)分干燥，管內(nèi)稍有點(diǎn)殘余的乙醇也沒(méi)關(guān)系。干燥一會(huì)就迅速加DEPC水少量。提取RNA之后迅速反轉(zhuǎn)錄成cDNA再保存。 |
5樓2019-03-11 09:03:09
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