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yesucao木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線
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最近在做實(shí)時(shí)熒光定量PCR，做出來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.992，但是計(jì)算的擴(kuò)增效率很高，120%（90-105%正常），這樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線估計(jì)是不能用于下一步的計(jì)算中，想請(qǐng)問(wèn)一下大蝦們：擴(kuò)增效率高的原因是什么？？怎么避免過(guò)高的擴(kuò)增效率？？ 接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)是要重新設(shè)計(jì)引物嗎？ |
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孫啟亮
金蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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| 擴(kuò)增效率高，說(shuō)明你體系里可能有目的基因的抑制劑。但我感覺(jué)多半是你基因本身的問(wèn)題，你可以多做幾次。其實(shí)擴(kuò)增效率120%是可以接受的，系統(tǒng)誤差的稍微變化都可能是這個(gè)結(jié)果，樓主不必?fù)?dān)心 |
2樓2012-04-01 10:06:01
你是路人甲
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擴(kuò)增效率是用來(lái)形容引物和模板結(jié)合及pcr反應(yīng)的效率的。是反應(yīng)本身的特質(zhì)。 PCR擴(kuò)增效率比理論值偏高，大多是由于反應(yīng)體系中含有PCR阻害物質(zhì)，需要改進(jìn)模板提取方法。另外，使用SYBR Green I嵌合熒光法檢測(cè)時(shí)，有時(shí)非特異性擴(kuò)增也會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率高，要通過(guò)融解曲線分析加以確認(rèn)。 有可能你的引物設(shè)計(jì)有問(wèn)題，需要重新設(shè)計(jì)。我們實(shí)驗(yàn)室打算提取小鼠血樣中的DNA做后續(xù)的BIODAI SYBR Green 熒光定量PCR,SYBR染料法需要同時(shí)看線性圖譜的CT值和溶解曲線是否是單峰 |
3樓2019-02-13 10:11:22
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