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landscape37新蟲 (小有名氣)
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[求助]
原核表達(dá)IPTG誘導(dǎo)后樣品處理
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有幾個(gè)問題搞不清楚，請(qǐng)高手給點(diǎn)經(jīng)驗(yàn) 1.IPTG誘導(dǎo)后的2,4,6..小時(shí)后還需要測OD嗎？那要保證上樣量一致來看哪個(gè)時(shí)期蛋白表達(dá)量最高，是根據(jù)取相同菌液，離心，然后加相同細(xì)胞裂解液，取相同量跑電泳嗎？要等一起處理樣品的話，如何保存呢？ 2.關(guān)于周質(zhì)空間的分離：我的載體有信號(hào)肽，所以我想分離周質(zhì)空間跑電泳，看我的蛋白表達(dá)情況，有一個(gè)protocol裂解液直接用200mM Tris-HCL+20%蔗糖，pH8.0（菌液離心，裂解液重懸沉淀，注意用槍頭吹打，不能渦旋，置于冰上1個(gè)小時(shí)，其間shake幾次，然后4度15000g離心30min，取上清即得周質(zhì)部分）。 但是我看其他很多細(xì)胞裂解液都是要有破裂細(xì)胞壁的EDTA還有溶菌酶，才能得到周質(zhì)空間，上面的做法可行嗎？我參照的下面是另外一個(gè)普通的protocol： [3].取菌液離心，轉(zhuǎn)移上清，上清液中加入等體積冰浴冷的10% TCA，冰上放置20min，高速離心后棄上清，用1ml甲醇洗滌沉淀2次，標(biāo)記為A，即菌液部分。 [4].在細(xì)菌沉淀中加入100μl 細(xì)胞裂解液重懸細(xì)菌，置冰上10min。 [5].高速離心后移出上清液，將上清液標(biāo)記為B，即周質(zhì)部分。 [6].在沉淀中加入100μl 0.1mM Tris-HCl (pH8.0)重懸沉淀，經(jīng)干冰和37℃水浴反復(fù)凍溶3次，高速離心后移出上清液，將上清液標(biāo)記為C，可溶性胞質(zhì)部分。 [7].在沉淀中加入100μl 0.1M Tris-HCl (pH8.0)重懸沉淀，標(biāo)記為D，即包涵體部分。 ps：我覺得第六步中的0.1mM Tris-HCL濃度是不是太低了，應(yīng)該是0.1M吧？ |
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landscape37
新蟲 (小有名氣)
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2樓2012-03-12 13:10:24
3樓2012-03-12 19:59:37
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