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[交流]
模板濃度高會影響反轉(zhuǎn)錄結(jié)果嗎?
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我用同一種的模板，做了兩次反轉(zhuǎn)錄，第一次加10微升模板，40微升反轉(zhuǎn)錄體系；第二次加15微升模板，同樣試劑盒，40微升反轉(zhuǎn)錄體系。然而第二次反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA濃度比第一次還要低，很奇怪。 我知道模板濃度高會影響反轉(zhuǎn)錄效率，但是怎么還會降低cDNA的濃度？我總認(rèn)為如果模板濃度過高，反轉(zhuǎn)不下去，也就達(dá)到40微升體系中CDNA的最大濃度，不知這個想法是否是錯誤的？請各位多指教``` |
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koko1210(金幣+1): 謝謝參與
送鮮花一朵
wanhscn(金幣+8, MolEPI+1): very good! 授予專家指數(shù)！辛苦！ 2012-03-15 00:01:26
koko1210(金幣+1): 謝謝參與
送鮮花一朵wanhscn(金幣+8, MolEPI+1): very good! 授予專家指數(shù)！辛苦！ 2012-03-15 00:01:26
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加模板不是要看體積，要看RNA的量哦。反轉(zhuǎn)錄試劑盒上會有關(guān)于RNA模板用量的說明，可參考下。不知道你用了多少RNA，所以不好說。RNA過量至少帶來2個問題： 1.反轉(zhuǎn)錄酶能力有限，RNA過量會造成反轉(zhuǎn)錄不完全，就是說有的RNA沒能反轉(zhuǎn)錄成cDNA。如果用來定量，結(jié)果就會不準(zhǔn)確。 2.提取RNA的過程中使用的試劑會影響酶活性，所以體積不能加太多，一般不要超過反轉(zhuǎn)錄體系的1/10（具體請參考試劑盒說明書）。 另外，測cDNA濃度是很奢侈的行為。反轉(zhuǎn)錄酶那么貴，cDNA是很珍貴的，不要浪費。一般的做法是測RNA濃度，然后不同樣品都使用同樣量的RNA去做反轉(zhuǎn)錄，這樣得到的不同樣品的cDNA就可以認(rèn)為濃度是一樣的。 |
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2樓2012-03-14 22:28:20
3樓2012-03-15 17:57:05
5樓2012-03-22 13:31:23
簡單回復(fù)
2012-03-15 18:03
回復(fù)
koko1210(金幣+1): 謝謝參與
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